技术鉴定连翘中45种化学成分(KQ-300DB使用 )

连翘为木犀科连翘属植物连翘[Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl]的干燥果实，气微香，味苦，性微寒，归肺、 心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效， 有“疮家圣药”之称。连翘在临床上常用于治疗痈疽、瘰 疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦 渴等症 。现代药理研究显示，连翘具有抗炎、抗病毒、 解热镇痛、止呕、保肝等作用，具有重要的开发价值 。 然而，目前研究者对连翘化学成分的研究多集中于单个 成分的提取分离与结构鉴定 ，检测手段单一，在线分 离与系统分析的报道较少，且所建立方法不能全面反映 连翘药材的组成，这限制了对其药效物质基础的全面认 识及多成分的快速定性定量分析，不利于该药材资源的 深入开发与利用。随着对连翘药理作用研究的深入，其 化学成分的全面快速鉴定成为亟待解决的问题。

1 材料

1.1 仪器

Acquity UPLC 型 UPLC 仪（美国 Waters 公司）；AB Sciex Triple-TOFTM 5600 型 MS 仪（美国 Sciex 公司）； 昆山舒美KQ-300DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公 司）；BSA224S-CW型电子天平、BP211D型电子天平（德 国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

连翘酯苷A、连翘苷、绿原酸对照品（成都瑞芬思生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 L-012-171216、L010- 170301、L-007-160504，纯度均≥98％）；芦丁对照品（国 家食品药品检定研究院，批号：100080-200707，纯度：≥ 98％）；甲醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）；乙腈（色 谱纯，德国 Merck 公司）；甲酸（色谱纯，美国 Fisher 公 司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3 药材

连翘药材（青翘，采收时间为 2018 年 6 月，批号： 180601）购于北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，经 黑龙江省中医药科学院霍金海副研究员鉴定为木犀科 连翘属植物连翘[F. suspensa（Thunb.）Vahl]的果实。药 材粉碎后过三号筛，备用。

2 方法

2.1 LC条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1％甲酸水溶液（A）-0.1％甲酸 乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，5％B→25％B；3～ 13 min，25％B→80％B；13～23 min，80％B→100％B； 23～23.1 min，100％B→5％B；23.1～25 min，5％B）；流 速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 MS条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子化模式：电喷雾 正、负离子模式；离子喷雾电压（ESI + /ESI －）：5 500 V/－4 500 V；离子源温度：550 ℃，去簇电压：80 V/－80 V；碰撞能量：35 eV/－35 eV，碰撞活化扫描能量：15 eV； 雾化气体：N2；雾化气、辅助气压力：379.2 kPa；气帘气压 力：241.3 kPa；质量扫描范围：80～1 500 Da。对响应值 超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，子离子质 量 扫 描 范 围 为 50～1 500 Da，开 启 动 态 背 景 扣 除 （DBS）。采用 Analyst TF 1.6 软件进行数据采集，采用 PeakView 2.0软件进行数据处理。

2.3 供试品溶液的制备

取连翘细粉约1.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功 率：300 W，频率：100 kHz）处理30 min；放冷后，再次称 定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀；溶液以0.22 µm微 孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液的制备

取连翘酯苷 A、连翘苷、绿原酸、芦丁对照品适量， 精密称定，分别置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容， 分别制成质量浓度均为20 μg/mL的对照品溶液，即得。

2.5 UPLC-MS分析

取“2.3”“2.4”项下对照品溶液和供试品溶液，按 “2.1”“2.2”项下 LC 与 MS 条件进样测定，记录色谱图， 用于后续成分筛查与结构鉴定。

3 结果

经与对照品图谱及相关文献数据对照，并结合 UPLC-MS所测得化合物的高分辨相对分子量结果进行 成分分析，共鉴定出连翘药材中的45个化合物，包括7 个苯乙醇苷类成分、5个木脂素类成分、5个萜类成分、12 个黄酮类成分、7个有机酸类成分、2个酚类成分、2个醌 类成分、2个苷类成分和3个其他成分。本研究共鉴定出45种化合物，主要包括木脂素类、 黄酮类、萜类、有机酸类等。选择每一类化合物的代表 性化合物，同时考虑到连翘酯苷 A 和连翘苷为 2015 版 《中国药典》（一部）中连翘项下含量测定的主要特征性 成分，故对连翘酯苷A、连翘苷、松脂醇、金丝桃苷、汉黄 芩苷、阿魏酸和奎宁酸等7种化合物进行裂解特征分析。连翘含有大量的黄酮类成分，主要包 括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等结构母核，据文献报道，连 翘中含有金丝桃苷。36号化合物在ESI－模式下的准 分子离子为m/z 463[M－H]－，糖链均裂脱去1分子半乳 糖形成碎片离子m/z 300[M－H－C6H11O5] －；糖链异裂脱 去 1 分 子 半 乳 糖 形 成 碎 片 离 子 m/z 301[M － H － C6H10O5] －；基峰离子 m/z 300 失去 1 分子 CO 和 1 个 H 形 成碎片离子m/z 271[M－H－C6H11O5－CO－H]－；碎片离 子m/z 301失去1分子CO和1分子H2O形成碎片离子m/z 255[M－H－C6H10O5－CO－H2O]－。

4 讨论

采用的UPLC-Q-TOF-MS 技术能够在较短 时间内完成复杂成分的分析工作，为连翘的化学成分鉴 定提供了一种高效的分析方法。中药材成分复杂， 且不同成分之间的含量相差悬殊，UPLC系统采用粒径 小于 2 µm 的柱填料用于成分分离，与传统高效液相色 谱（HPLC）系统普遍采用的5 µm柱填料相比，前者理论 板数更高，可获得更好的分离效果。由于连翘中含有大 量的黄酮类化合物，因此本课题组在流动相中加入 0.1％甲酸，以提高黄酮类化合物检测的灵敏度。质谱条 件选择的离子喷雾（ESI + /ESI－ ）电压为 5 500 V/－4 500 V，在这个电压条件下，所有离子都能获得较高的电离效 率。去簇电压选择80 V/－80 V，在这个电压条件下，可以 有效消除溶剂的离子簇，也可防止母离子发生源内裂解。



 

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