测定血液中11种喹诺酮类药物残留(KQ-600使用)

1 引 言

喹诺酮类药物是一类具有抗菌作用的人工合成药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、毒副作用小、价格低 廉等特点，被广泛用于治疗各种感染性疾病。然而，该类药物容易导致耐药菌株的产生，且具有潜在的 致癌性和遗传毒性，可能对人体健康造成潜在风险。在畜牧和养殖领域，由于不合理用药、不遵守 休药期等原因，导致药物可能会超标残留于生物体内。为确保动物源性食品质量安全，开发喹诺酮类药 物残留的检测方法至关重要。目前，《中华人民共和国药典》( 2015 年版) 中针对喹诺酮类药物的检测 方法主要为分光光度法和高效液相色谱法，报道的方法包括高效液相色谱-串联质谱法、毛 细管电泳法、酶联免疫法和胶体金法等。其中，分光光度法、酶联免疫法和胶体金法操作简 单，但选择性较差，灵敏度较低; 毛细管电泳法快速高效，但分离重现性较差。高效液相色谱-串联质谱 法兼具灵敏度高、特异性好等优势，是目前喹诺酮类药物残留检测的常用方法。

2 实验部分

2．1 仪器与试剂

ACQUITY 超高效液相色谱仪( 美国 Waters 公司) ; QTＲAP 6500+三重四极杆/复合线性离子阱质谱 仪、Analyst 和 MultiQuant 数据处理系统( 美国 SCIEX 公司) ; Milli-Q Integral 5 型超纯水仪( 美国 Merck Millipore 公司) ; AB204-S 型电子天平( 瑞士 Mettler Toledo 公司) ; CＲ 21N 型高速冷冻离心机( 日本 Hitachi 公司) ; MS3 型涡旋振荡器( 德国 IKA 公司) ; 昆山舒美KQ-600型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限 公司) 。 甲醇、乙腈和四氢呋喃( 色谱纯，美国 Fisher 公司) ; 正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇和正十 二醇( 百灵威科技有限公司) ; 正庚醇和正壬醇( 日本 TCI 公司) 。11 种喹诺酮类化合物标准物质: 萘啶酸 ( 99．5%) 、恶喹酸( 98．0%) 、盐酸环丙沙星( 95．0%) 、达氟沙星( 97．5%) 、恩诺沙星( 98．0%) 、那氟沙星( 99． 0%) 、司帕沙星( 99．0%) 、盐酸双氟沙星( 97．5%) 和盐酸莫西沙星( 96．1%) 购自德国 Dr． Ehrenstorfer 公司) ; 培氟沙星( 98．0%，加拿大 TＲC 公司) ; 氧氟沙星( 98．8%，中国食品药品检定研究院) 。11 种喹诺酮类化 合物的基本信息见表 1。


2．2 实验方法

2．2．1 标准溶液的配制

准确称取 11 种喹诺酮类化合物标准物质各 10 mg( 精确至 0．1 mg) ，分别用表 1 中对应的溶剂溶解并定容至 10 mL，配制成浓度为 1 mg /mL 的标准储备溶液。分别取 11 种喹诺酮类化合 物标准储备溶液，配制成浓度为 20 μg /mL 的混合标准储备溶液，4℃保存。使用时以甲醇逐级稀释成系列 浓度的标准工作溶液，现用现配。

2．2．2 超分子溶剂的制备

移取 2．5 mL 正己醇和 8 mL 四氢呋喃，迅速注入 50 mL 离心管中，加入 29．5 mL 水，以 420 r/min 磁力搅拌 3 min，3000 r/min 离心 10 min，用注射器移取上层有机相于适宜容器 中，4℃密封保存。

2．2．3 样品处理

采用活体取血法取血后立即移取 0．1 mL 血液样品，置于预先加入 0．2 mL 超分子溶剂的 2 mL 聚丙烯离心管中，涡旋振荡 3 min，以 5000 r/min 离心 10 min。移取上层液体 50 μL 于0．3 mL微量进 样瓶中，加入 50 μL 甲醇混匀，过 0．22 μm 微孔滤膜后，待超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质 谱测定。

2．2．4 分析条件

( 1) 色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18( 50 mm×2．1 mm，1．7 μm) ; 流速: 0．35 mL/min; 流动相: 0．15%甲酸水溶液( A) 和乙腈( B) 。
( 2) 梯度洗脱程序 0～1．8 min，10% ～30% B; 1．8～2．2 min， 30%～90% B; 2．2～3．2 min，90% B; 3．2～3．5 min，90% ～10% B; 3．5～5．0 min，10% B; 柱温: 30℃; 进样 量: 2 μL。
( 3) 电喷雾质谱 电喷雾离子源; 正离子扫描; 离子源温度: 150℃; 喷雾电压: 5500 V; 气帘 气流速: 30 psi，雾化气流速: 60 psi，脱溶剂气流速: 60 psi; 脱溶剂气温度: 600℃; 碰撞气设置: 高。
( 4) 多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式( MＲM-IDA-EPI) 扫描范围: m/z 50～415; 扫描速 度: 20000 Da /s; 碰撞能量: ( 35±15) V。

3 结果与讨论

( 1) 烷基醇种类 选用两亲性有机溶剂四氢呋喃分别与碳原子数 C5 ～ C12的烷基醇 ( 正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇) 和水组合形成超分子溶剂，对 11 种喹诺酮类化合物进行萃取。11 种物质的萃取率随着烷基醇碳原子数的增加，整体呈现下降的趋势。反向胶束超分子溶剂萃取作用力主要包括烷基链的疏水相互作用和亲水头基的氢键作用。 当烷基醇碳链较长时，疏水相互作用占优势，适合萃取极性小的物质; 当烷基醇碳链较短时，氢键作用占优 势，适合萃取极性大的物质。随着碳链长度的减小，超分子溶剂相给质子能力会随之提高，从而使分子 间作用力增强，喹诺酮类化合物萃取率增加。总体而言，正己醇具有较好的萃取效果( 萃取率为 65．0% ～ 113．1%) ，而正辛醇及碳链更长的烷基醇的萃取率较低。另一方面，喹诺酮类物质的化学结构中含有苯环、 哌嗪环、环丙烷等结构，导致其空间位阻变大，短链烷基醇更容易克服空间位阻而与氢键位点结合，有助于 提高萃取效率。因此，最终选择正己醇用于后续优化试验。
( 2) 烷基醇用量 保持超分子溶剂总体积为 40 mL，四氢呋喃用量为4 mL，分别选取正己醇用量为 1、1．5、2、2．5、3、3．5 和 4 mL 进行了考察。当正己醇用量大于 2．5 mL 时，样品可获得较好的萃取效率。
( 3) 四氢呋喃用量 考察了四氢呋喃 用量为 2、4、6、8、10 和 12 mL( 保持超分子溶剂总体积为 40 mL 及正己醇用量为 2．5 mL) 的萃取情况 ，结果表明，四氢呋喃用量在 8～10 mL 时可获得较好的萃取效果。
( 4) 涡旋时间 在超分子溶剂 萃取过程中，通过涡旋振荡可以加速超分子溶剂和目标化合物之间充分混合，促进传质过程。比较了涡旋 时间为 1、2、3、5、7 和 9 min 时的萃取效果 ，当涡旋时间在 3～7 min 时，可获得较理想的萃取效果。 通过单因素试验确定各参数的大致优化范围后，通过正交试验对超分子溶剂萃取条件进行进一步优化。

4 结 论

建立了超分子溶剂分散液液微萃取结合超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱测定血液 中 11 种喹诺酮类药物残留的分析方法，通过单因素和正交试验考察了影响萃取效果的烷基醇种类与用 量、四氢呋喃用量等关键因素，并进行了相关的统计学分析。在最佳条件下，利用多反应监测-信息关联采 集-增强子离子扫描复合模式测定 11 种待测化合物的检出限为 0．1～0．8 μg /L，定量限为 0．4～2．0 μg /L; 在 低中高 3 个加标水平下的平均回收率为 70．8% ～115．2%，相对标准偏差为 3．0% ～11．5%。




 

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