延胡索总生物碱的急性毒性分析-KQ-500DE使用

延胡索又名元胡、延胡、元胡索，是罂粟科植物延 胡索（Corydalis Rhizoma）的干燥块茎，为历代中医 药学家推崇的镇痛药，具有活血化瘀、理气止痛等功 效。《本草纲目》记载延胡索“专治一身上下诸痛”， 《本草正义》云其“……主一切肝胃胸腹诸痛……”。

1 仪器和材料

1.1 主要仪器

JA2003N 电子天平购于上海精密 仪器有限公司；XS105 分析天平购于梅特勒-托利多 仪器有限公司；昆山舒美KQ-500DE 型数控超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司；RE-3000 旋转蒸发 仪为上海亚荣生化仪器有限公司产品；DGG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱购于上海森信实验仪器有限公 司；Millipore Synergy 超纯水系统为美国密理博公司 产品。

1.2 药品和试剂

延胡索总生物碱为本课题组自制 （质量分数 68.19%）；延胡索乙素对照品购于中国食 品药品检定研究院（质量分数 99.80%，批号：110726- 201414）；冰醋酸购于天津市永大化学试剂有限公司 （批号：20131006）；0.9%氯化钠注射液购于山东齐都 药业有限公司（批号：2A15102402）；阿司匹林维生素 C 泡腾片购 于拜耳 医药 保 健有限 公 司 （批 号： BTAEEA1/2）；盐酸吗啡注射液购于东北制药集团沈 阳第一制药有限公司（批号：150911-1）。

1.3 实验动物

SPF 级 ICR 小鼠 200 只，雌雄各半， 4～6 周龄，体质量（20±2）g，由上海西普尔-必凯实验 动物有限公司提供 [实验动物生产许可证号：SCXK （沪）2013-0016]；SPF 级 KM 小鼠 100 只，雌性，4～6 周龄，体质量（20±2）g，由上海斯莱克实验动物有限责 任公司提供 [实验动物生产许可证号：SCXK （沪） 2012-0002]。所有小鼠均饲养于浙江中医药大学动物 实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013- 0184]，相对湿度 40%～50%，室温 20～25℃。普通饲料 喂养，自由摄食，充分给水。

1.4 方法

1.4.1 对照药物配制

阿司匹林维生素 C 泡腾片以 超纯水溶解并定容，配制成终浓度为 10mg·mL-1 的阿 司匹林溶液 20mL 备用。10mg·mL-1 盐酸吗啡注射液，以 0.9%氯化钠注射液稀释，配制成 1mg·mL-1 的盐酸 吗啡注射液 20mL 备用。延胡索乙素对照品以超纯水 配制成浓度为 1.5mg·mL-1 的混悬液 20mL 备用。

1.4.2 镇痛试验药物剂量设置

取延胡索总生物碱 原料药，以超纯水分别配制成 5 个不同浓度的延胡索 总生物碱混悬液各 20mL，含总生物碱含量分别为 12、6、3、1.5、0.75mg·mL-1，分别为更高剂量组、高剂量 组、中剂量组、低剂量组、更低剂量组。

1.4.3 延胡索总生物碱小鼠急性毒性试验

1.4.3.1 预试验

选取 ICR 小鼠 50 只，雌雄各半，分 为 5 组，每组 10 只，禁食不禁水 12h 后以不同剂量的 延胡索总生物碱混悬液灌胃，观察各组小鼠死亡情 况，测定动物最小全致死量 (minimum lethal dose， Dm) 和最大全不致死量 (maximum non lethal dose， Dn)，确定剂量范围。

1.4.3.2 急性毒性试验

选取 ICR 小鼠 70 只，雌雄 各半，分 7 组，每组 10 只，灌胃前禁食不禁水 12h。根 据预试验确定的 Dn～Dm 范围，按比例配制成 6 组剂 量梯度的延胡索总生物碱药液各 20mL 备用。第 1～6 组小鼠分别以不同剂量的 6 组药液灌胃给药 1 次，给 药量为 0.4mL·10g-1；第 7 组为正常组，灌胃等体积超 纯水。给药后每日观察，连续 2 周，期间正常饮食。记 录所有小鼠出现的症状及死亡情况，对试验期内死亡 的小鼠和试验结束后处死的正常组小鼠进行尸体解 剖，观察各脏器的病理变化。以 Bliss 法计算小鼠 LD50 及 95%置信区间。

1.4.4 延胡索总生物碱镇痛作用研究

1.4.4.1 小鼠醋酸扭体试验

选取 ICR 小鼠 80 只， 雌雄各半，经适应性饲养 1 周后，随机分成 8 组，每组 10 只，分别为：空白对照组（超纯水组）、阳性对照组 （阿司匹林组）、延胡索乙素组、更高剂量组、高剂量 组、中剂量组、低剂量组、更低剂量组，各药物剂量分 别参考 1.4.1 和 1.4.2。各组小鼠均灌胃给药，给药量 为 0.4mL·20g-1。各组小鼠给药后 1h，经腹腔注射 0.6%冰醋酸 0.2mL·20g-1，然后记录 15min 内小鼠的 扭体次数，计算扭体次数抑制率。 扭体次数抑制率（%）=（空白对照组扭体次数-各 给药组扭体次数）/空白对照组扭体次数×100%

1.4.4.2 小鼠热板致痛试验

选取 KM 小鼠 100 只， 适应性饲养 1 周后，放入（55±0.5）℃的热板中，从 中筛选出合格的雌性小鼠 80 只 （凡舔后足时间小于 5s 或大于 30s 的弃之不用）。将合格小鼠随机分 成 8 组，空白对照组（超纯水组）、阳性对照组（盐 酸吗啡注射液组）、延胡索乙素组、更高剂量组、高 剂量组、中剂量组、低剂量组、更低剂量组，每组 10 只，各药物剂量分别参考 1.4.1 和 1.4.2。盐酸吗啡 注射液经腹腔注射，0.2mL·20g -1，其他各组均灌胃 给药，0.4mL·20g-1。各组于给药前重复测量痛阈 3 次，取平均值作为该小鼠给药前痛阈值。给药 后 30、90、180min 各测定 1 次痛阈值。 1.5 统计学分析 应用 SPSS 20.0 统计软件进行统 计学分析，计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单 因素方差分析，组间两两比较采用 t 检验。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

按照设定的剂量一次灌胃给药后，部分小鼠出现 精神状态不佳、眼眶变黑等现象，大约半小时出现抽 搐、尿失禁、死亡；随着剂量增高，此反应加强；未达到 致死剂量的小鼠给药后出现短暂的精神倦怠现象，随 后活动正常。对处死的正常组小鼠及急性毒性试验 死亡小鼠进行解剖可知，小鼠脏器外形、体积、色泽均 正常，无充血、肿胀和坏死等异常病理表现。与空白对照组比较， 各给药组对冰醋酸所致的小鼠扭体均具有显著的抑 制作用，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；与阿司匹 林组比较，除延胡索乙素组和延胡索总生物碱更低剂 量组扭体次数增多外（P＜0.01），其他各组扭体次数差 异无统计学意义（P＞0.05）；与延胡索乙素组比较，除 延胡索总生物碱更低剂量组外，其他各组扭体次数均 减少（P＜0.01，P＜0.05）。与延胡索乙素组比较，仅延胡索总生物碱更低剂 量组 3 个时间段痛阈值短于延胡索乙素组（P＜0.05）； 而延胡索总生物碱更高剂量组、高剂量组 3 个时间段 痛阈值均长于延胡索乙素组；中剂量组、低剂量组给 药 30min 后痛阈值也长于延胡索乙素组，给药 90min 与 180min 后痛阈值则短于延胡索乙素组，但均无统 计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

LD50 是预期引起 50%动物死亡的剂量，是评价药 物，包括从中药、天然药物中提取的有效部位安全性 的重要指标之一，对后期实验的剂量设置和制剂的制 备具有重要参考价值。小鼠急性毒性试验结果表明， 延胡索总生物碱的 LD50 为 473.36mg·kg-1，提示延胡索 总生物碱具有一定的毒性，为后续制剂研制剂量设置 提供了实验依据，其长期毒性还需进一步考察研究。