超声处理对大豆亲脂蛋白结构及溶解性的影响
来源：未知
发布日期：2019-09-02 14:01【大 中 小】
采用超声处理可减少液滴尺寸进而提高小麦蛋白和大豆分离蛋白的乳化性。因此，超声可作为提高LP溶解性及结构特性的手段。然而，超声条件处理对LP的影响研究尚属空白。因此，本文昆山舒美超声仪器有限公司探究超声处理对LP的结构及溶解性的影响，在超声功率（120~480W）和超声时间（10min、20min）的处理条件下，更好地了解超声对LP的物化作用，并确定出最佳的超声条件，在保留LP必要结构特性的基础上提高其溶解度及其他功能特性，以期为LP的进一步应用奠定基础.
1.仪器与设备
分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；CL-2型恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；6L落地式冻干机，上海汇分电子科技有限公司；LGR20-W型台式高速冷冻离心机，北京京立离心机有限公司；Delta320型pH计，梅特勒-托利多仪器公司；FJ200-SH型数显高速分散均质机，上海标本模型厂；MAGNA-IR560傅里叶变换红外光谱仪，美国NICOLET公司；F-4500型荧光分光光度计，日本HITACHI公司；Q1000示差扫描量热仪，美国TA仪器；UV-5100型高性能紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器；Phomo型酶标仪，郑州安图实验仪器有限公司。
1.2傅里叶红外光谱分析
昆山舒美超声仪器有限公司将超声处理后的大豆分离蛋白溶液进行冻干，冻干后的样品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取样品1.5mg，与200mg溴化钾研磨混匀后压片进行红外光谱测定。在实验过程中，为了减少蒸汽的干扰，用干燥的N2持续注入测量室。测定时波数范围为4000~400cm-1，扫描次数为64次，分辨率4cm-1，得到的红外吸收曲线采用Peakfitting软件和高斯曲线拟合，分析大豆亲脂蛋白不同超声功率下的二级结构含量的变化。
1.3内源荧光光谱分析
将20mg/mL大豆蛋白溶液用pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释到0.1mg/mL，取一份稀释液3mL置于石英比色皿中扫描荧光图谱。扫描条件为：记录发射波长200~500nm，激发波长设置为290nm，增长间隔为10nm。
1.4外源荧光
采用ANS作为荧光探针测定蛋白质的外源荧光强度。分别称取0.025g不同品种蛋白样品溶于50mL磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH值7.0）中，在室温条件下搅拌1.0h后离心（10000g，30min），取上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白浓度，并用磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH值7.0）依次稀释蛋白，使其质量浓度在0.005~0.1mg/mL之间，将所得梯度的上清液溶液与8.0mmol/LANS以100:1混合，静置3min后测其荧光强度。激发波长390nm，发射波长4970nm，夹缝为5nm。以荧光强度对蛋白质浓度制图，初始段斜率即为蛋白质分子的外源荧光强度。
1.5差示扫描量热法
昆山舒美超声仪器有限公司参照文献的方法，用铝制坩埚称取3.0mg（干基）样品，按料液比6mL/g加入去离子水，压盖密封后，置于室温平衡后测定，差示扫描量热法（DSC）测量使用DSC-60型差示扫描量热计以10℃/min的扫描速率在30-140℃的范围内进行。使用热分析系统（TA-60WS）软件测定变性峰的温度。
1.6溶解性
参照文献的方法稍作修改测定大豆分离蛋白溶解性，用质量浓度约为10mg/mL的蛋白质溶液（pH值8.0），搅拌1h使样品溶解，静置2min后，将上清液到入离心管中离心15min(10000g)。取上清液2μL稀释10倍，采用BCA法测定蛋白质含量。以牛清蛋白为标准物，蛋白质溶解度为上清液中蛋白的含量占样品中总的蛋白含量的百分比。
2结束语
超声处理对LP的结构及溶解性具有相当大的影响，超声处理后在电泳图中分子量未发现明显变化，而亚基含量有所改变，而经红外、荧光光谱分析后发现其二级、三级结构发生明显变化。超声处理后LP分子间的非共价键减少，分子解折叠，减少了蛋白质分子的再聚集，提高了其变性温度及结构稳定性，而结构的改变导致功能性质的改变。昆山舒美超声仪器有限公司认为在本研究中，超声功率为360W时处理10min，及超声功率为240W时处理20min，对LP的溶解性及疏水作用的改善效果最佳，而继续增加超声功率及超声时间，则会对LP的性能产生负面影响，可能由于过剩的能量导致蛋白质过度解折叠，大量疏水残基暴露，重新形成了不溶性聚集体。由于溶解性会影响大多数蛋白质的功能性质，因此有必要确定出最佳的超声功率及时间，为改善LP的理化性质及功能性质提供最佳的预处理条件。
