浅谈豌豆水溶性多糖的电镜扫描分析

豌豆(Pisum sativum)是我国重要的食用豆类之 一，是具有粮食、蔬菜、饲料和医药等多种用途的作 物。现代药理表明豌豆有增强机体免疫功能、防癌 治癌、通利大肠等作用，药用价值显著(崔再兴, 李 玲, 2010)。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆(Pisum sativum)品种'成豌 8 号'，由四川省 农业科学院提供，2017 年收获，研磨后置于-40 ℃ 冰箱中储藏。所用化学试剂均为分析纯，购自北京 广达生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Hitachi S-3400N扫描电子显微镜(日本Hitachi 公司)；1093 CYCLOTEC 旋风磨(瑞典 Foss 公司)； 全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)； KQ-500E型超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)；UV759CRT型紫外可见分光光度计(上海佑科 仪器公司)；SHZ-D (Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 豌豆粗多糖的提取

豌豆利用自来水浸泡6 h后手工去皮，在 70 ℃ 条件下干燥过夜，然后研磨并过 80 目筛。豌豆粉 末加入 95% 乙醇(1∶30, W/V)在 23 ℃下提取 24 h，以除去脂肪、色素以及小分子杂质。利用装有布氏 漏斗的抽滤瓶连接循环水真空泵进行减压抽滤，滤 渣依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮以及石油醚 清洗后风干，得到预处理的豌豆粉末。参照 Li 和 Shah(2016; 2014)的方法稍作修改，取预处理豌豆 粉置于95.0 ℃热水(1∶30, W/V)，150 W 超声提取3 h，离心得到上清液；残渣重复以上操作 1~2 次，利 用 RE-52AA 型旋转蒸发仪，80 ℃旋转蒸发浓缩， 除去水分。用三倍体积的80%乙醇在4 ℃沉淀24 h；10 000 r/min，离心10 min，分离获得下层白色沉 淀，冷冻干燥，得到粗多糖(crude polysaccharides of pea, CPP)。

1.3.2 测定多糖含量

采用硫酸苯酚法(Dubois et al., 1956; Imjongjairak et al., 2016)测定豌豆多糖含量。多糖被浓硫 酸水解为单糖，产生的单糖与苯酚结合生成有色物 质，于 490 nm 下有最大吸收峰。利用吸光值与糖 含量的线性关系，对多糖进行定量测定。配制浓度 为 0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液，制作标准曲线，得到 回归方程：Y=14.994X–0.0304 (R2 =0.9997)。

1.3.3 粗多糖的脱蛋白处理

参考Peng等(2016)的方法，略加修改。粗多糖 水溶液中加入一定比例(1/3~1/4)的 Sevag 试剂(正 丁醇∶氯仿=1∶5~1∶4)。剧烈振荡反应一段时间(20 min)，然后离心15 min (6500 r/min)。离心后，除去 有机层和水层交界处变性的蛋白质，收集上层清 液。重复上述操作若干次，以尽可能地除去粗多糖 中所含的粗蛋白。收集水层并浓缩，以95%乙醇沉 淀，离心(3000 r/min, 20 min)沉淀物，以无水乙醇洗 涤，冷冻干燥，即可得到脱蛋白处理的豌豆脱蛋白 多糖(deproteinization of polysaccharides, TPP)。

1.3.4 超滤

采用截留分子量为 5 kD 的中空纤维超滤膜 3个组件联用的办法，豌豆粗多糖提取液在室温、压 力0.2 MPa条件下进行连续超滤处理，至浓缩多糖 截留液为原体积的 1/5。冷冻干燥，样品放置 4 ℃ 冰箱中保存。

2 结果与分析

利用超声辅助提取豌豆可溶性多糖，粗多糖得 率为7.26%；豌豆中淀粉、蛋白占比较多，所以可溶 性多糖的得率较低。粗多糖通过脱蛋白处理，多糖 保留率为 87.45%；随着蛋白的脱出会流失一部分 蛋白多糖，并且会破坏多糖，使得多糖有一定的损 失率。脱蛋白后的多糖进行水洗脱和NaCl洗脱， 依次过离子交换柱与葡聚糖凝胶柱，分别得到WDEPP (13.92%)、N - DEPP1 (22.75%)、N - DEPP2 (2.03%)、W - DE - GPP - a (38.91%)、W - DE - GPP - b (17.53%)、N-DE-GPP1-a (35.28%)、N-DE-GPP1-b (6.39%)(图1)。

观察粗多糖(CPP)扫描电镜图中代表性的多糖 结构。当 CPP 被放大 100 倍时，表面呈现光滑、不 规则的薄片状结构；锁定片状结构，将CPP放大到 1 000倍时，多糖碎片表面略微凹凸不平，有孔洞； 放大到10 000倍，CPP表现平整、致密的平面结构，最后低倍镜下观察到的孔洞呈干裂破损状。

3 讨论

扫描电镜通过电子枪发射出电子束，在加速电 压作用下，电子检测器捕获样品室中样品表面的电子信号形成图像(Martin et al., 2006; Holbrook et al., 2006)。近年来，随着扫描电镜技术的普及和应 用，扫描电镜对大分子颗粒超微形貌的观察，成为 全面分析大分子结构特性必不可少的一种辅助研 究手段(王绍清等, 2011)。另外，扫描电子显微镜在 对多糖等生物大分子表面形貌的观察研究中得到 越来越多的应用(Sun et al., 2017)。本研究对从豌 豆中提取的粗多糖依次进行不同纯化处理，通过扫 描电镜观察多糖颗粒结构，发现其表现出明显的微 观形态变化及特征规律，随着多糖组分的一步步纯 化，其宏观颗粒逐渐细化变小，而微观结构基本保 持致密稳定的状态。