昆山舒美浅谈水稻中的5种砷形态的分析

不同砷 （As） 形态的毒性差异很大。 一般 认 为， 无机砷（iAs）的毒性高于有机胂， 三价砷的毒 性大于五价砷。 甲基化的形态胂也具有一定的遗传 毒性和致癌性。 除饮用水外， 大米是人体砷摄入 的重要来源。 不同品种的稻米及其制品中有机胂 和 iAs 的含量差异很大。 已证实稻米 As 形态不 同， 其生物有效性、 毒性也不同。 因此， 用总 As 评估砷毒性虽简单易行， 但并不科学。 只有对稻 米中各种形态 As 进行全面分析， 才能对稻米 As 的 安全性作出科学、 客观评价。 为此， 有必要建立稻 米中 As 形态的检测方法。

1260 infinity 高效液相色谱 仪 （美国 Agilent 公司）、 7700 电感耦合等离子体 质谱仪 （ICP－MS， 美国 Agilent 公司）， EASY 超 纯水机 （DUBUQUE， IOWA， U.S.A）、 PM400 电 子天平 （瑞士 METTLER 公司）、 PHS－3C 精密 pH 计 （上海雷磁仪器公司）、 MS3 basic 漩 涡 振 荡 仪 （德国 IKA 公司）、 KQ－800TED型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、 5804R 台式高速冷冻 离心机 （德国 eppendorf 公司） 等。

甲醇 （色谱纯， Merck）， 磷酸氢二铵、 磷酸二氢铵、 碳酸铵、 硝酸铵、 磷酸 （GR 级， 广州化学试剂厂）， 三氟乙酸 （TFA， 纯 度≥95.0％， ACS）， 硝酸 （68％～70％， GR 级， 广州化学试剂厂）， 实验室用水为 Milli－Q 高纯水。 砷 标 准 溶 液 ： As （ V） （GBW08667） 、 As （ III） （GBW08666） 、 MMA （ GBW08668） 、 DMA （GBW08669） 以及 As 单标准储备液 （1 000 mg/L） 均购于国家标准物质中心， ASA （99.99％） 购买 于阿拉丁试剂有限公司。 5 种 As 形态混合标准储 备液： 用纯水将 As （III）、 As （V）、 MMA、 DMA 4 种 As 形态稀释成质量浓度均为 400 mg/L （以 As 计） 的标准储备液， 用甲醇将 ASA 溶解成质量浓 度 为 400 mg/L （以 As 计） 的 标 准 储 备 液， 置 于 4℃冰箱中避光保存。 砷标准工作液和混合标准工 作液现用现配。 实验用的稻米和水稻植株样品来源于添加 ASA 的盆栽实验。

首先对 ICP－MS 的仪器条件 进行确定， 再筛选和优化色谱条件， 确定 HPLC－ ICP－MS 的条件。 根据此条件， 进行方法学考察， 主要包括检出限、 定量限、 线性范围、 精密度的确 定。 结合加标回收方式考察方法准确度。 保留时间 定性， 峰面积定量。 采 用 1 μg/L 的 7 Li、 59Co、 89Y、 115In、 140Ce、 205Tl、 238U 调谐液对仪器参数进行优化。 该条件确 保 ICP－MS 仪器的工作正常运行， 并且保证质谱 条件一样的情况下考察 HPLC 条件的可行性。 通过 微调载气流量、 稀释气流量、 碰撞器流量、 RF 电 压、 透镜偏转电压等参数， 使仪器的灵敏度最高， 同时氧化物和双电荷的产率最低， 双电荷、 分辨率等指标符合 ICP－MS 仪器最佳测定条件。 优化后 的 ICP－MS 工作参数见表 1。

（四） 样品前处理 稻米样品的前处理

取待 测稻米样品于旋风研磨仪中粉碎， 过 100 目筛， 准 确 称 取 样 品 0.3000 g， 置 于 50 mL 聚 丙 烯 离 心 管 中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 涡旋混匀， 再置 于超声波清洗器中室温提取 30 min 后， 在 10 000 r/min 下 离 心 30 min， 上 清 液 过 0.22 μm 滤 膜 后， 放在 4℃冰箱里， 供 HPLC－ICP－MS 分析。 水稻植株样品的前处理： 水稻植株的样品经打 浆机粉碎后， 称取 0.300 0 g， 置于 50 mL 聚丙 烯 离心管中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 后续操作 同稻米样品前处理方法。 空白实验是直接向 50 mL 聚 丙 烯 离 心 管 中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 后续操作同稻米样品 前处理方法。

按照 BATISTA 等 给出的方法， 采用单标和混标进样方式进行确定。 结果表明， 使用 10 mM HPO4 2－/HPO4 － （98％ v/v） + 甲 醇 2％ （ v/v） （pH 8.5） 作 为 流 动 相 时， As （Ⅲ） 峰 分 叉， As （Ⅴ） 出 峰 时 间 长， ASA 未 出 峰。 使用甲醇－0.1％ （体积分数） 三氟乙酸水溶液 （体 积 比 1∶9） 作 为 流 动 相 时， ASA 在 40 min 内未出峰。 使用 20 mmol/L （NH4）2HPO4 （pH 6.0） 和 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH 值为 8.5） 作为流动相梯度洗脱时， ASA 与 As （Ⅲ） 、 As （Ⅴ） 、 DMA、 MMA 峰达到基线分离， 但 As （Ⅲ）、 As （Ⅴ）、 DMA、 MMA 的 4 个峰未基线分离， 峰交叉 与重叠严重。 选择水和 50 mM （NH4）2HPO4 （pH 值为 6.0） 梯度洗脱作为流动相时， As （Ⅲ）、 As （Ⅴ ） 、 DMA、 MMA、 ASA 分 离 效 果 较 好 。 但ASA 的保留时间约为 23 min， 该法检测一个样品 耗时长 （需 25 min）， 且梯度设定较为麻烦。 若没 有多元泵， 就难以进行梯度洗脱， 方法将受到限 制。 另外， 方法研究中发现， 使用梯度洗脱会导致洗 脱后期基线上升。 考虑到 ASA 溶于有机试剂， 试 探性地使用 50 mM （NH4）2HPO4 （pH＝6.0） 和 2％ 甲 醇 等 度 洗 脱 ， 结果该组合能够 较好地将 As （Ⅲ） 、 DMA、 MMA、 As （Ⅴ） 、 ASA 分 离 开 来 （保留时间分别为 1.861、 2.032、 4.698、 7.505 和 13.664 min）， 且洗脱时间在 15 min 内。 为此， 选 择 （NH4）2HPO4 +甲醇作为流动相的组成成分。

本研究建立了水稻中 5 种砷形态的高效液相色 谱－电感耦合等离子体质谱联用测定方法。 结果表 明， 本方法适合于水稻各组织中 As（V）、As（III）、 DMA、 MMA 和 ASA 5 种砷形态的准确定性和定 量分析。 该方法便捷、 快速、 灵敏度和准确度高、 检测重现性好、 耐用性强。 通过测定水稻组织砷形 态可见， ASA 能够直接被水稻根吸收， 并可转化 为 As （V）、 As （III）、 DMA、 MMA 形 态 分 布 在 水 稻 的 茎 ， 叶 ， 米 等 组 织 ， 较为系统地考察了 ASA 在水稻体内的归趋特征。 由于大米中砷形态 比例发生了变化， 为此， 大米的食用安全性要以形 态分析为基础更科学。 由于 iAs 毒性较大， 使水稻 的毒性增大， 再加上水稻植株中砷含量增加， 有必 要加大对 ASA 使用及畜禽粪便的监管。



 

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