易混淆品HPLC鉴别

维吾尔药乌斯乃为松萝科松萝属植物节松萝 Usnea diffracta Vain． 的干燥全草，性平和，具有收敛营养力、消散 淤结、爽身强心、调经助阳的功效，用于久泻、久咳、心 悸气短、癫痫、神失、心烦阳弱、呕恶气喘、月事不调、 毒蛇咬伤。前期课题组在市场调查中发现，乌斯乃使用 的药材各异，来源复杂，作为 《中华人民共和国卫生部药 品标准 维吾尔药分册》收载品种，标准中仅有 “理化鉴 别”项，难以判断药材的真伪，保证其入药的准确性及 临床的有效性。 本研究对乌斯乃的市场流通及临床应用情况进行调查， 并建立乌斯乃及其替代品、易混淆品的 HPLC 鉴别方法。 该方法快速、简便、专属性强，可为该药材的准确、安全 使用及质量标准的提升提供数据支持。

乌斯乃及其替代品、易混淆品 ( 图 1) 收集于新疆和 田维吾尔市场、甘肃药材市场，经中国科学院微生物研究 所真菌学国家重点实验室郭守玉研究员鉴定，凭证标本存 放于新疆维吾尔自治区中药民族药研究所。 松萝酸、黑茶渍素为实验室自制 ( 结 构 经1 H-NMＲ、 13 C-NMＲ、MS 等波谱技术鉴定) ，HPLC 法测定其含有量均 大于 99%。微孔滤膜 ( 0. 22 μm，天津市津腾实验设备有 限公司) 。HPLC 所用试剂均为色谱纯; 水为超纯水。 Waters2695 高效液相色谱仪 ( 美 国 Waters 公 司) ; PDA2998 检测器 ( 美国 Waters 公司) ; Shimpack PＲEP-ODS ( HKIT) C18色谱柱 ( 250 mm×4. 6 mm，5 μm，日本岛津公 司) ; 电子天平(德国赛多利斯天平) ; KQ5200DB 超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司) 。

走访调查，以及对资深专业 人士的访谈。

Shimpack PＲEP-ODS ( HKIT) C18色谱柱 ( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) ; 流 动 相 甲 醇-1% 乙 酸 ( 79 ∶ 21) ; 柱温 30 ℃; 检测波长 285 nm; 体积流量 1. 0 mL/min; 进样量 10 μL。

取样品约 0. 1 g，精密称定，置 于具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯 50 mL，密塞，称定 质量，超声 ( 200 W、40 kHz) 提取 40 min，取出，放冷， 再称定质量，乙酸乙酯补足减失的质量，摇匀，滤过，取 续滤液，即得。

精密吸取各供试品溶液 10 μL， 注入高效液相色谱仪，在 “2. 2. 1” 项色谱条件下进样。 对不同供试品 HPLC 色谱图的峰数、峰面积、相对保留时 间等参数进行比较，优化图谱。

将样品色谱图导入 “中药色谱指纹图谱 相似度评价系统 ( 2004 年 A 版) ”软件，分析相似度。

课题组对各地维吾尔药材 市场及维吾尔医院的调查发现，乌斯乃替代品、易混淆品 常见的有梅衣属植物槽梅衣 Parmelia sulcata，条衣属植物 条衣 Everniastrum cirrhatum、中华金丝 Lethariella sinensis 和 长松萝 Usnea longissima。

隶属于梅衣科梅衣属地衣，叶状，上表 面矿灰色，有光泽，下表面黑色，具有假根，致密，富分 枝; 髓白色; 分生孢子器不发达; 子囊盘表面生，罕见。 主要生长在岩石或树皮上，分布于新疆等地。

3. 1. 2 条衣

隶属于梅衣科条衣属叶状地衣，上表面浅 灰至灰色，下表面黑色; 裂片边缘整齐，稍向内卷，有时 成沟状，裂片深裂成条带状，形成二叉状分枝，髓白色， 边缘常有纤毛或假根。主要生长在松树或其他灌木的枯枝 上，分布于云南、河北等地。

梅衣科金丝属地衣，具有真菌和藻类 共生形成的特殊复合生物，多年生，枯草黄至黄绿色; 丝 体呈圆柱形或扁圆形，丝状体表面呈网状棱脊，基部污白 色，向上渐次赭黄或桔黄色，无光泽，稍卷曲，顶端渐尖， 无粉芽，子囊盘及分生孢子器。主要生长在高海拔雪山地 带的松树枯枝上，分布于西藏、云南、四川等地。

松萝科松萝属枝状地衣，灰绿色，成 线状，下垂，长可达 100 cm。外皮粗松，中心坚密。子器 稀少，皿状，生于枝的先端。主要生长在松树或其他树的 树皮上，分布于东北、陕西、安徽、浙江、广东、云南、 西藏等地。

精密吸取空白溶液 10 μL，注入高效 液相色谱仪，结果表明空白不干扰测定。

同一供试品溶液在 “2. 2. 1”项色 谱条件下连续进样 7 次，测得主要色谱峰面积及保留时间 ＲSD 为 0. 30%，表明仪器精密度良好。

取同批药材 6 份，按 “2. 2. 2”项 下方法制备供试品溶液，在 “2. 2. 1”项色谱条件下进样， 测得主要色谱峰面积及保留时间 ＲSD 为 0. 96%，表明该方 法重复性良好。

取同一供试品溶液，分别于 0、1、2、4、6、12、24 h 在 “2. 2. 1”项色谱条件下进样，测得 主要色谱峰面积及保留时间 ＲSD 为 0. 47%，表明供试品溶 液在 24 h 内稳定性良好。

乌斯乃及其替代品、易混淆 品的 HPLC 图谱见图 2，包括色谱峰数、相对保留时间、色 谱峰峰面积及比例，可直观地发现乌斯乃及其替代品、易 混淆品上述指标差异很大。以乌斯乃正品为对照，利用相 似度软件进行分析，发现替代品、易混淆品与其相似度很 低，条 衣、中 华 金 丝、槽 梅 衣、长 松 萝 分 别 为 0. 003、 0. 004、0. 003、0. 001。 由 HPLC 色谱图可知，在 30 min 内条衣有 16 个特征色 谱峰，其 中 易 于 辨 识 的 有 9 个， 最具特征性的在 11. 263 min处，峰形大; 中华金丝有 7 个分离度较好的色 谱 峰，18. 620、24. 068 min 处 为 其 特 征 峰，黑 茶 渍 素 ( 24. 068 min) 所占比例为 59. 90%; 乌斯乃有 10 个色谱 峰，13. 301、19. 376、21. 669 min 处为其特征峰，且三者 含有量达 90%; 槽梅衣有 9 个特征峰，主要集中于11 min 前，其中 5. 208 min 处所占比例达 80%; 长松萝有 9 个特 征峰，以 10. 934、18. 950 min ( 松 萝 酸) 为 主，两 者 占 99. 75%。 4 讨论与结论 课题组在甘肃、新疆、四川、东北等地的调查发现， 乌斯乃野生资源非常少，仅在黑龙江红星林场中生长，蕴 藏量极低。目前，药材市场上未见有节松萝出售，现新疆 维吾尔医院及药材市场用的乌斯乃主要是槽梅衣和条衣。 据 《中华本草》 ( 维吾尔药卷) 记载，长松萝也是乌斯乃 药材的来源之一，随着用药的规范化，新疆维吾尔药厂现 在用的基本为该品种。中华金丝由于形态和节松萝有诸多

的相似之处，一直误作为节松萝使用和出售，基于此，课 题组发现乌斯乃用药问题存在相当长一段时间，直接影响 了药物有效性和临床安全性，对于这些药物是否可以代替 乌斯乃入药还需要进一步的证实。

乌斯乃常见替代品、易混淆品为梅衣属、松萝属植物， 松萝属植物以缩酚类、二苯并呋喃类、蒽醌类等成分为主， 但是均含有松萝酸; 梅衣属植物主要含有黑茶渍素、藻 纹苔酸、protocetraric 等成分; 条衣属植物含有生物碱、 皂苷、鞣质类。金丝属植物主要含有一些色素类物质( canarione、1，2-quinone derivatives、rubrocashmeriquinone、 7-chlororubrocashmeriquinone、7-chlorocanarione ) 。 由 此 可 见，乌斯乃与其替代品、易混淆品化学成分的差异较大， 因此可用 HPLC 法进行鉴别。

本实验建立了乌斯乃 HPLC 图谱，与市场上常用的替 代品、混淆品相比，其共有峰数差异明显，表明化学成分 存在较大区别，它们能否应用于临床还需进一步研究。

同时，该方法基线稳定，易于操作，重复性好，能有 效地区分乌斯乃及其替代品、易混淆品，可为该药材的鉴 别及质量控制提供参考依据。