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枸杞为茄科植物宁夏枸杞 Lycium barbarum L． 的干燥成 熟果实，是我国传统名贵药材，具有调节免疫功能、保肝、 抗氧化损伤、抗肿瘤等药理作用，一般认为与其所含枸 杞多糖、类胡萝卜素和黄酮等活性成分相关。早期研究 主要针对枸杞多糖和黄酮类，近年来开始关注类胡萝卜素 类，并发现其在人体内的多种生物活性，作为 VA 的来源 治疗皮肤角化症、猝灭单线态氧、清除自由基、防止细胞 膜损伤、调控机体免疫应答等。目前，枸杞质量标准未 对类胡萝卜素类含有量进行限量要求，文献也主要集中在 不同成熟度、加工方式枸杞中其含有量变化方面，但关于其指纹图谱及不同产地聚类分析的研究较少。本实 验从指纹图谱和指标成分含有量测定 2 方面同时对枸杞质 量进行定性和定量评价，旨在为药材质量的全面评价提供 参考依据。
Thermo Scientific Ultimate 3000 高效液相色谱仪 ( 美国赛默飞公司) ; KQ-400KDE 高功率数控超声波清洗器 ( 昆山超声仪器有限公司) ; Mettler AE240 电子分析天平 ( 十万分之一，法国施耐德电器有限公司) ; Sartorius AG BS 电子分析天平 ( 万分之一，法国施耐德电器有限公司) 。
二氯甲烷、正己烷、乙腈、甲醇 ( 色谱 级，美国 Fisher 公 司) ; 石 油 醚、丙 酮 ( 色 谱 纯，德 国 Merck 公司) ; 甲醇、无水乙醇，分析纯 ( 北京化工厂) ; 娃哈哈纯净水 ( 杭州娃哈哈集团有限公司) 。对照品玉米 黄素 ( 河南省标物生物科技有限公司，批号 170417，含有 量≥98%) 、β-胡萝卜素 ( 河南省标物生物科技有限公司， 批号 170108，含有量≥98%) 、玉米黄素双棕榈酸酯 ( 上 海同田生物技术股份有限公司，批 号 144-67-2，含 有 量≥98%) 。
收集宁夏、甘肃、新疆、青海和内蒙古 5 个产 地共 35 批枸杞样品，经北京中医药大学刘春生教授鉴定鉴 定为茄科植物宁夏枸杞 Lyciumbarbarum L． 的干燥成熟果实。 信息见表 1。
Diamonsil C18 色谱柱 ( 4. 6 mm× 250 mm， 5 μm) ; 流 动 相 乙 腈-甲 醇-正 己 烷-二 氯 甲 烷 ( 40 ∶ 15 ∶ 20 ∶ 20) ; 体 积 流 量 1 mL/min; 柱 温 25 ℃ ; 检 测 波 长450 nm; 进样量 10 μL。
取玉米黄素、β-胡萝卜素适量，分别 精密称定 1. 04、2. 13 mg，加入二氯甲烷溶解后，流动相分 别定容于 10、100 mL 量瓶中; 取玉米黄素双棕榈酸酯适量， 精密称定 9. 21 mg，加入玉米黄素、β-胡萝卜素对照品溶液 各 1 mL 后，流动相定容于 5 mL 量瓶中，即得。玉米黄素、 β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯质量浓度分别为 20. 80 μg /mL、4. 26 μg /mL、1. 84 mg /mL。
提取方法参考陈敏报道并进行调 整。称取 1 g 枸杞粉末，精密称定，加入 0. 01% BHT ( 二 丁基羟基甲苯) ，15 mL 石油醚-丙酮 ( 2 ∶ 1) 混合溶剂常 温提取 3 次至残渣无色，每次 30 min，合并提取液，转入 分液漏斗，蒸馏水洗去水溶性成分，石油醚层用无水硫酸 钠干燥，旋转蒸发浓缩至干，石油醚定容至 25 mL，微孔 滤膜过滤，取续滤液，即得。提取过程避光。
精密吸取同一供试品溶液 10 μL，在 “2. 1”项色谱条件下连续进样 6 次，以 1 号峰玉米黄素为 参照峰，得各共有峰相对保留时间 ＲSD 0. 44% ～ 2. 57%， 相对峰面积 ＲSD 0. 94% ～ 2. 84%，表明仪器精密度良好。
取同一批次枸杞粉末 6 份，制备供试 品溶液，精密吸取 10 μL，在 “2. 1”项色谱条件下进样， 以 1 号峰玉米黄素为参照峰，各共有峰相对保留时间 ＲSD 1. 32% ～ 2. 93%，相对峰面积 ＲSD 1. 21% ～ 2. 85%，表明该 方法重复性良好。
取同一供试品溶液，在 “2. 1”项色 谱条件下于 0、2、4、8、12、24 h 进样，各共有峰相对保 留时间 ＲSD 0. 98% ～ 2. 59%，相 对 峰 面 积 ＲSD 1. 41% ～ 2. 52%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。
选取宁夏、甘肃、青海、新疆每个产 地各 3 批次枸杞药材的 HPLC 图，导入中药指纹图谱相似 度评价系统中，选择中位数计算方法，确定最佳时间窗宽 度为 0. 1 min，采用多点校正，经过色谱峰自动匹配，生成 对照图谱，进行色谱峰整体相似性评价，见图 1，不同产 地 12 批样品 HPLC 色谱图整体峰形一致，相似度 0. 924 ～ 0. 991，见表 2，表明不同产地枸杞化学成分相近，具有较 好的均一性。共标定 9 个共有峰，保留时间为 2. 01 min 处 的 1 号色谱峰响应较高，分离良好，故选作参照峰。
枸杞中的类胡萝卜素类成分主要包括类胡 萝卜素和类胡萝卜素酯两大部分。本实验首先对甲醇乙腈 ( 45 ∶ 55) 流动相体系进行了研究，结果发现甲醇-乙 腈体系无法洗脱出枸杞中的类胡萝卜素酯类成分，这可能 是由于类胡萝卜酯类成分极性太小的原因。通过向流动相 中添加一定比例的正己烷和二氯甲烷，可以有效地洗脱出 类胡萝卜素酯类成分。值得注意的是，常规反相高效液相 色谱仪的在线脱气装置对正向溶剂的耐受性较差，本实验 通过调整流动相流路，使流动相不经过在线脱气装置直接 进入泵元件，避免了溶剂对仪器原件的损害。流动相在使 用前，需要提前混合均匀并超声脱气。
由于玉米黄素双棕榈酸脂色谱峰占总色谱 峰面积的 70%以上，给相似度计算带来较大误差，故进行 指纹图谱相似度匹配时舍去此峰。不 同 产 地 12 批 样 品 HPLC 色谱图的整体峰形一致，相似度 0. 924～ 0. 991。利用 平均数法计算平均图谱，作为 HPLC 对照指纹图谱为枸杞 类胡萝卜素类成分质量评价的依据。此外，35 批样品的聚 类分析表明，宁夏、青海枸杞聚为一类，表明 2 个产地枸 杞化学成分更为相近，具有较好的均一性。
含有量测定结果表明，不同产地枸杞中含有的化学成 分种类差异不大，但本实验测定的 3 种成分含有量具有较 大差异，最高的为玉米黄素双棕榈酸酯 ( 21. 03 mg /mL) ， 以青海德令哈 ( S23、S18) 、宁夏中宁 ( S8) 较高; 其次 为玉米黄素 ( 0. 141 8 mg /mL) ，以宁夏中宁 ( S11) 、青海 德令哈 ( S24) 较高; β-胡萝卜素最低 ( 0. 010 6 mg /mL) ， 以青海德令哈 ( S23、S24) 较高，这是由于玉米黄素和 β 胡萝卜素为玉米黄素双棕榈酸酯的生物合成前体，随着枸 杞的生长成熟，枸杞中玉米黄素双棕榈酸酯的含有量逐渐 增加，而且是类胡萝卜素积累的主要形式，也是成熟枸杞 的特征类胡萝卜素。因此，本实验选择该 3 种成分作为 枸杞质量评价的指标。 此外，通过测定不同产地枸杞中类胡萝卜素含有量发杞质量更为相似，与聚类分析结果一致。
综上所述，本研究建立枸杞 HPLC 指纹图谱，并测定 3 种成分的含有量，该方法简便准确，重复性好，可为该药 材质量控制提供参考。
