基于固相萃取膜盘技术分离富集海水中软骨藻酸

当前，海洋环境污染日趋严重，赤潮现象频频发生。由赤潮生物暴发所产生的大量生物毒素通过食 物链进入人体，进而威胁人类健康。软骨藻酸( Domoic acid，DA) 是一种具有神经毒性的氨基酸类化 合物，是记忆丧失性贝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-拟菱形藻( Pseudo-nitzschia) 产生。DA 能够引 起海洋哺乳动物及人类中毒，甚至死亡。鉴于其对人类健康存在的潜在威胁，国际食品法典委员 会( CAC) 规定贝类中 DA 的安全限量为 20．0 μg /g ，美国、加拿大、欧盟、日本和中国等国家相继执行 此国际标准。

近年来，有害拟菱形藻及其产生的 DA 在全球海域的分布范围逐渐扩大。本格拉上升流海域 检测到 DA 的最高浓度达 180 ng /L ; 在法国北海海域近岸海水中 DA 浓度在 102～263 ng /L 之间。 2015 年 5～8 月在美国北部西海岸暴发的一次大规模产毒拟菱形藻藻华事件，造成大量海豚、海狮及海 鸟死亡，在该海域螃蟹等海产品中检出高浓度 DA，已超出其安全限量范围; 2017 年中国近海发现能 够产生 DA 的拟菱形藻，南海海域多个批次海产品中也检出 DA，在扇贝中的累积量高达 10．1 μg / g 。DA 对海产养殖业带来了严重威胁，因此需对 DA 进行有效检测与监测。目前，DA 的检测方法主 要有生物分析法、高效液相色谱法、荧光检测法、质谱法、酶联免疫分析法和毛细管电泳 法等。其中，高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱联用技术具有准确性高、稳定性好的特点，是目 前测定 DA 的最佳方法。海水是海洋养殖生物的栖息地，海水中毒素的浓度水平直接影响海产品的食 用安全，而对海洋养殖环境水体中毒素的有效检测是海产养殖安全管理的前提。由于海水中 DA 含量 较低，且 DA 是一种极性较大的亲水性物质，对高盐海水基质中的 DA 直接进行仪器检测和快速富集比 较困难。无定型 TiO2 、分子印迹聚合物、磁性材料等常被用作吸附剂，对海水中的 DA 进行分 离富集，然而这些吸附材料还未实现产业化生产，无法进行广泛推广应用。采用商品化C18固相萃取柱可实现海水中 DA 的富集，但富集倍数仅 20 倍; 利用商品化的反相 C18固相萃取膜盘对海水中的 DA 进行富集时，富集倍数为 20 倍，回收率达 90．0%以上，然而通过增加海水上样量提高富集倍数时，方法 的回收率明显下降，说明该方法富集倍数和效率低，不适于海水中痕量 DA 的高效富集。因此，急需 开发对海水中痕量 DA 分离效果好、富集倍数高，并且能够推广应用的新富集方法。

固相萃取膜盘技术由于具有盘片上吸附剂分布均匀、超低溶出及动力学高效率( 高流速不会影响 回收率) 的特点，在大体积水样处理中具有传统 SPE 小柱无法比拟的优势，已成为环境水体微量污染物 快速富集、净化的高效方法。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯( SDB-ＲPS) 共聚物材质且对极性 化合物有高效吸附性的固相萃取膜盘，结合高效液相色谱-紫外检测/质谱分析法，建立了一种针对海水 中痕量 DA 进行高效富集测定的新方法，并将其应用于东海海域海水样品中 DA 的测定。

1220 型高效液相色谱仪、6320 型电喷雾离子阱质谱仪( 美国 Agilent 公司) ;电子天平 ( 赛多利斯) ; Milli-Q 超纯水处理系统( 美国 Millipore 公司) ; KQ-400KDE 型高功率数控超 声波仪( 昆山市超声仪器有限公司) ; ＲE100-pro 旋转蒸发仪( 北京大龙公司) ; 磺化苯乙烯-乙烯基苯 ( SDB-ＲPS) 固相萃取膜盘、C18固相萃取膜盘( 47 mm，美国 3M 公司) ; 5 TC-C18( 2) 色谱柱( 150 mm× 4．6 mm) 、Poroshell 120 色谱柱( 100 mm × 3． 0 mm) 、ZOＲBAX 300 SB-C18 色谱柱( 150 mm × 3． 0 mm， 3．5 μm) 均购于美国 Agilent 公司; 0．22 μm 混合纤维膜( 上海市新亚净化器件厂) 。 甲酸( 色谱纯) 、乙酸铵( 优级纯) ( 瑞士 Fluka 公司) ; 甲醇、乙腈( 色谱纯，美国 TEDIA 公司) ; 丙 酮、异丙醇( 色谱纯，德国 Merck 公司) ; DA 标准品( 美国 Sigma 公司) ; 实验用水为 Milli-Q 超纯水 ( 18．2 MΩ cm) 。

色谱条 件: Agilent 5 TC-C18 ( 2) ( 150 mm × 4． 6 mm，5． 0 μm) 色 谱 柱，90． 0% ( V /V) 乙 腈 ( 含 2．0 mmol /L 乙酸铵+0．1%甲酸) 为流动相，等度洗脱，柱温 35℃，流速 1．2 mL /min，二极管阵列检测器 ( DAD) 检测波长 242 nm，进样量 20．0 μL。与质谱联用分析时，由 HPLC 流出进行分流，使得进入质谱 的流动相流速为 0．3 mL /min。 质谱条件: 电喷雾正离子模式检测，全扫描范围为 m /z 100 ～ 500，干燥气温度 350℃，干燥气流速 10．0 L /min，喷雾气压力 206．8 kPa。二级质谱分析选择 DA 的母离子为［M+H］+ ( m /z 312．2) ，生成特征 碎片离子 m /z 266．2、294．2、248．2。

取 2．0 L 海水样品，经孔径为 0．22 μm 的滤膜过滤去除悬浮颗粒物，加入 8．0 mL 甲酸进行酸化处 理，然后进行固相萃取膜盘富集。首先对 SDB-ＲPS 固相萃取膜盘进行活化处理: 加入 10．0 mL 丙酮，使 丙酮溶液通过膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 异丙醇，使异丙醇溶液通过膜片浸泡 30 s，抽干; 加入 10．0 mL 甲醇，待甲醇溶液只剩约 1．0 mL 时，加入 10．0 mL 水，待膜片上保留约 1．0 mL 水时，固相萃取膜 盘完成活化。取酸化后的海水样品，以 6．0 mL /min 的流速过固相萃取膜盘，加入 20．0 mL 水对膜盘进 行淋洗，抽干; 使用 20．0 mL 80．0%( V /V) 甲醇分 2 次对 DA 进行洗脱，合并洗脱液，采用旋转蒸发仪在 50℃下将洗脱液进浓缩至干，用 1．0 mL 乙腈-水( 1∶ 19，V /V) 复溶，转移到进样小瓶中，待测。

由文献可知，DA 有较强的紫外吸收，为了能获得较高的灵敏度，在 210 ～ 400 nm 范围内进 行扫描。由 DA 的紫外吸收光谱图( 图 1A) 可见，DA 的最大吸收峰在 242 nm 处，因此选择 242 nm 作为 DA 的最佳检测波长，这与文献结果一致。反相 C18色谱柱常用于 DA 的 HPLC 分离分析; 考 虑到 DA 是一种极性较大的弱酸性化合物，在反相 C18色谱柱上保留较弱，本研究以水-乙腈混合液为流动相，对 3 根同一厂家不同碳载量的 C18色谱柱( 5TC-C18( 2) 、Poroshell 120、ZOＲBAX 300 SB-C18色谱柱) 进行 了比较，结果表明，Agilent 5 TC-C18( 2) 色谱柱的分离效果最理想，分离度高，并且峰形尖锐对称，说明不 同的色谱柱对海水中的 DA 分离结果差异较大，选择碳载量相对较低的 C18柱尤为关键。在最佳色谱分离 检测条件下，对添加 DA 标准品的海水样品进行了分析，色谱图如图 1B 所示，DA 色谱峰尖锐对称，与海 水中的干扰组分达到了良好分离，可以准确积分其峰面积，进而对海水中 DA 进行定量测定。

4 结 论

建立了一种基于固相萃取膜盘富集的高效液相色谱-紫外检测/质谱测定海水中溶解态 DA 的新方 法。与传统的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盘法的海水样品上样速度快、富集倍数高、不易堵塞，适 于在调查船对海水中微量 DA 的现场快速富集。利用 SDB-ＲPS 固相萃取膜盘对 2．0 L 海水中微量 DA 进行快速富集，富集倍数高达 2000 倍，方法回收率和重复性良好，使常规高效液相色谱-紫外检测法达 到了测定实际海洋环境水体中 DA 的灵敏度要求。本研究也为大体积远洋环境水体或极地海水中痕量 有机物现场快速富集方法的建立提供了新思路，为解决海水样品体积大、不易在调查船上长期冷冻保存 和运输的难题提供了新方法。