昆山舒美对树莓叶黄酮提取的正交试验

黄酮类化合物作为抗氧化作用显著的一类天然产物，其可应用于心脑血管疾病、肿瘤、炎症等治疗， 树莓叶黄酮同样具有应用价值及研究意义。目前树莓叶提取物的研究主要包括树莓叶中水杨酸、鞣花酸和黄酮，其中已有研究表明，树莓叶黄酮分离组分主要包括芦 丁、檞皮素和山奈酚衍生物，故本研究拟采用乙醇浸提法从树莓叶中提取芦丁等黄酮类成分，采用紫外分光光度法对所含总黄酮进行了测定，以及通过建立 ＨＰＬＣ 完成了 树莓叶黄酮的初步分离，从而完成了黄酮中芦丁含量的准确测定，为树莓叶研发芦丁兽用中药制剂提 供理论参考。

红树莓叶，采自宁夏某树莓种 植园；芦丁 标 准 品，购自北京索莱宝科技有限公司 ；甲 醇、乙 醇、石 油 醚、乙 酸 乙 酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为分析纯试剂。

高效液相色谱仪，美国 Ｗａｔｅｒｓ公司产品；８４５３型紫外分光光度仪，美国 Ａｇｉｌｅｎｔ公 司 产 品；ＤＦＴ－２５０ 手 提 式 高 速 万 能 粉 碎 机，温岭市林大机械有限公司产 品；电子分析天平（赛多利斯）；恒 温 水 浴 锅 （ＤＺＫＷ－Ｄ－２型），北京市永光明医疗仪器厂产品；旋 转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司产品；ＫＱ－ ５００型超声波清洗器，昆山市超声清洗仪器厂产品。

将树莓叶经粉碎处理后，精 确称重１００ｇ，加入乙醇加热回流浸提后，取滤液经 石油醚、乙酸乙酯依次反复萃取，分离得最终乙酸乙 酯层棕红色液体，经旋蒸仪蒸发至１００ｍＬ，置４ ℃ 冰箱保存。将各粗提物 取１０μＬ 溶 解 于 甲 醇，并 定 容至１０ｍＬ容量瓶，４ ℃保存备用。

准确称 取 芦 丁 标 准 品 ４．００ｍｇ，用甲醇定溶于１０ｍＬ的棕色容量瓶中，充 分摇匀，得到芦丁质量浓度为０．４ｍｇ／ｍＬ的标准品 溶液，用０．４５μｍ 微孔滤膜过滤，４ ℃保存备用。

采 用 亚 硝 酸 钠－硝 酸铝比色法，以芦丁为标准品在５１０ｎｍ 处测定吸光 度，以吸光度（ｙ）对各质量浓度（ｘ）进行线性回归， 得回归方程ｙ＝３２．６ｘ－０．００４９（Ｒ２＝０．９９９２），线 性范围０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬ。

（ＨＰＬＣ）分离 利用反向色谱分离方法建立黄酮分离条件：ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒＢａｘＳＢ Ｃ１８色谱柱（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．５μｍ），流动相为 １ｍｇ／ｍＬ乙酸－乙腈＝７２．５∶２７．５，等度分离，柱温 ３０ ℃，检测波长：２５７ｎｍ；以芦丁为标准品建立标准 曲线，以色谱峰面积（ｙ）对各质量浓度（ｘ）进行线性 回归，得 回 归 方 程 ｙ＝４Ｅ＋０６ｘ＋２２１１９（Ｒ２ ＝ ０．９９９３），线性范围０．００２ｇ／ｍＬ～０．４ｇ／ｍＬ。

通过选择料液比（Ａ）、乙 醇浓度（Ｂ）、提取温度（Ｃ）和提取时间（Ｄ）设计单因 素试验设计（表１），考察各因素对黄酮提取率的影 响，每组试验重复３次，取平均值。

通过选择料 液 比（Ａ）、乙醇浓度（Ｂ）、提取温度（Ｃ）和提取时间设计四因素三水平正交试验和响应面设计试 验，考察各因素对黄酮提取率的影响，每组试验重复 ３次，取平均值。

２ 结果

测定结果 。 通 过 分 别 建 立 ＵＶ 和 ＨＰＬＣ色谱分离方法，对树莓叶黄酮按照正交试验和响应曲面试验最佳工艺所得提取物，进行初步分 离，并对芦丁含量进行准确测定和验证，树莓叶黄酮 中芦丁实际含量为１．５１４ｍｇ／ｇ，占总黄酮粗提物含 量的１３．４％。

树莓叶作为红树莓果树的副产物，而 黄 酮 作 为药用植物中普遍存在的天然活性成分，且树莓叶的黄酮类化合物含量高于果实，芦丁作为槲皮素 的一种糖苷衍生物，槲皮素和芦丁已被证实具有 抗肿瘤、保护心脑血管等多种生物学活性。 本试验通过建立 ＨＰＬＣ色谱分离方法，对树莓 叶黄酮按照正交试验和响应曲面试验最佳工艺所得提取物，进行初步分离，并对芦丁含量进行准确测定 和验证。本 试 验 最 佳 工 艺 所 得 树 莓 叶 黄 酮 提 取 率 １１２７ ｍｇ／１００ ｇ，显 著 高 于 徐 雅 琴 等报 道 的 ５３３．７１ｍｇ／１００ｇ，树莓叶芦丁的纯化及兽用中药制 剂工艺仍需进一步研究和探索。