超声清洗器在仿生酶解有效部位的最佳脱脂工艺

白芪龙胶囊主要由白花蛇舌草、黄芪、天龙 等 5 味中药组成，为自主研发的中药六类新药， 用于非小细胞肺癌等恶性肿瘤的辅助治疗，初步 临床应用取得了较满意效果。前期研究发现， 采用独特仿生酶解工艺制得的有效部位天龙小肽 抗肿瘤活性显著，为白芪龙胶囊发挥“祛邪”作 用的关键成分，然而天龙药材本身含有大量的油 脂成分(约 10%)严重干扰了天龙小肽的分级纯化和后续的制剂成型。本实验在文献研究基础上， 首次将固体石蜡法用于天龙油脂的脱除，重点对 固体石蜡法脱除有效部位天龙小肽中油脂的最佳 参数进行研究。

UV1100 型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；PHS-3C 型精密 pH 计(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-250 型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；TDL-5-A 型离心机(上海安亭科学仪器厂)；Millipore Labscale TFF 型超滤系 统(Millipore 公司)；HY-5 型回旋式振荡器(金坛市亿通电子有限公司)。

天龙，经山东中医药大学药学院生药教研室 李峰教授鉴定系壁虎科动物无蹼壁虎 Gecko swinhoana Guenther.的干燥全体；牛血清白蛋白(中 国食品药品检定研究院，批号：140619-201120)； 碱性铜试液、福林酚试液(按中国药典 2015 年版四 部附录 8002 项下配制)；高效切片石蜡(上海华永 石蜡有限公司，批号：20120801)；胃蛋白酶(国药 集团化学试剂有限公司，酶活力≥1 200 U·g1 ，批 号：F20070914)；胰蛋白酶(上海蓝季科技发展有 限公司，酶活力 1 000~1 500 U·mg1 ，批号： 091105)。

取天龙药材，粉碎，过 50 目筛，加 10 倍量 去离子水，搅拌加热至沸，放至室温，用稀盐酸 溶液调 pH 至 1.5~2.5，加入底物量 2%的胃蛋白酶 并搅拌均匀，37 ℃保温振荡 2 h，再用 10%氢氧 化钠溶液调 pH 至 7.5~8.5，加入底物量 2%的胰蛋 白酶并搅拌均匀，50 ℃保温振荡 4 h，并时时调 pH，使 pH 保持在 8.0 左右，煮沸杀酶，放至室温， 5 000 r·min1 离心 15 min，分离上清液，微滤 (0.22 μm)，得天龙仿生酶解液，1 kg 药材制得 10 L 酶解液。

精密量取一定体积的仿生酶解 液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上 蒸干后，于 105 ℃干燥 3 h，置干燥器中冷却 30 min，迅速精密称质量，计算得膏率(得膏率=干 膏质量/酶解液相当生药量×100%)。

以牛血清白蛋白为对照品，采用福林酚比色法测定酶解液中天龙总小 肽的含量。精密量取牛血清白蛋白对照品溶液 (0.225 4 g·L1 ) 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分 别置试管中，加水至 1.0 mL，加碱性铜试液 1.0 mL，摇匀，加入福林酚试液 4.0 mL，立即充 分混匀，置 55 ℃水浴中准确反应 5 min，马上置冷水浴中 10 min，按照 UV 法，在 650 nm 处测 定吸光度。以牛血清白蛋白加入量为横坐标，吸 光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y=2.678 2X0.022 8(r=0.998 4)，牛血清白蛋白加入 量在 0.045 08~0.225 4 mg 时线性关系良好。稳定 性、精密度、重复性试验等方法学考察均符合规 定(RSD 分别为 1.12%，1.33%，1.06%)，平均加样 回收率为 98.26%(n=6，RSD=1.93%)。精密量取适 当浓缩的仿生酶解液 1.0 mL，自“加碱性铜试液 1.0 mL”起依法测定吸光度，计算总小肽含量。

取天龙仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，分别稀释 1 倍、不浓缩、 浓缩至 1︰1，2︰1，3︰1 和 4︰1(m︰V)，趁热加 入相当天龙生药量 30%的固体石蜡，加热并搅拌 使完全熔化，保持微沸 5 min，静置冷却至室温， 冷藏(2~6 ℃)过夜，滤过，分离石蜡层，加适量水 洗涤 1 次，合并滤液。取滤液适量，分别进行评 价指标测定，得膏率分别为 30.6%，30.9%，33.2%， 33.9%，34.2%，35.8%，小肽含量分别为 20.1%， 19.9%，18.1%，18.3%，17.5%，17.9%。结果表明， 随着酶解液浓缩程度的增加，脱脂效果越差，且 有效成分损失严重(约 13%)，分析可能与石蜡层疏 松吸附有效成分、滤液黏稠呈混悬态等有关。综 合考虑，确定对酶解液不浓缩直接进行脱脂处理。

取天龙仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，分别趁热加入相当天龙生药 量 10%，20%，30%，40%，50%，60%的固体石 蜡，加热并搅拌使完全熔化，其余操作同“2.3.1” 项，测得得膏率分别为 37.7%，35.4%，30.2%， 28.4%，27.9%，28.8%；小肽含量分别为 19.2%， 18.8%，19.6%，20.9%，20.5%，21.3%。结果表明， 当石蜡用量≥40%时，滤液澄清，石蜡层分离彻底， 得膏率基本稳定在 28%左右，说明除脂彻底且无 石蜡残留；同时，有效成分的含量不受石蜡用量 的影响，稳定在 20%左右，因此暂定石蜡用量为 40%，待进一步考察。

取天龙仿生酶解液 6 份， 每份各 100 mL，趁热加入相当天龙生药量 40%的 固体石蜡，加热并搅拌使完全熔化，保持微沸 5 min，静置冷却至室温，分别冷藏(2~6 ℃) 2，4， 6，8，10，12 h，滤过，其余操作同“2.3.1”项， 测得得膏率分别为 30.9%，29.7%，25.2%，25.4%，24.9%，25.6%；小肽含量分别为 15.2%，16.4%， 18.2%，18.1%，18.7%，17.9%。结果表明，当冷 藏放置时间≥6 h 时，得膏率不再显著变化，基本 维持在 25%左右，小肽含量在 18%左右，说明油 脂已完全除去，且有效成分损失较少，因此暂定 冷藏时间为 6 h，待进一步考察。

取天龙仿生酶解液 5 份， 每份各 100 mL，趁热加入相当天龙生药量 40%的 固体石蜡，加热并搅拌使完全熔化，保持微沸 5 min，静置冷却至室温，分别在 2，4，6，8，10 ℃ 下冷藏 6 h，滤过，其余操作同“2.3.1”项，测得 得膏率分别为 26.5%，25.6%，26.1%，31.8%， 36.7%；小肽含量分别为 19.0%，19.4%，19.3%， 17.5%，16.2%。结果表明，冷藏温度是决定石蜡 层成型的关键因素，温度过高，石蜡凝固不充分， 油脂无法被石蜡充分溶出；当温度≤6 ℃时，得 膏率和小肽含量分别维持在 26%和 19%左右，有 限时间内石蜡层凝固充分，油脂去除完全，有效 成分几乎无损失，因此暂定冷藏温度为 2~6 ℃， 待进一步考察。

取天龙仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，趁热加入相当天龙生药量 40%的固体石蜡，加热并搅拌使完全熔化，保持微 沸 5 min，静置冷却至室温，冷藏(2~6 ℃) 6 h，滤 过，分离石蜡层，分别加适量水洗涤 0，1，2，3， 4，5 次，合并滤液。取滤液适量，分别进行评价 指标测定，得膏率分别为 25.7%，27.8%，28.2%， 28.5%，28.1%，28.6%；小肽含量分别为 18.9%， 20.2%，20.6%，21.0%，20.9%，20.5%。结果表明， 石蜡层对有效成分的吸附较少，水洗 2 次即可洗 涤完全，因此确定石蜡层的水洗次数为 2 次。

取天龙仿生酶解液 4 份， 每份各 100 mL，趁热加入相当天龙生药量 40%的 固体石蜡，加热并搅拌使完全熔化，保持微沸 5 min，静置冷却至室温，冷藏(2~6 ℃) 6 h，滤过， 分离石蜡层，加适量水洗涤 2 次，合并滤液，分 别进行重复脱脂操作 0，1，2，3 次。取滤液适量， 分别进行评价指标测定，得膏率分别为 28.2%， 27.3%，27.0%，27.2%；小肽含量分别为 21.0%， 20.9%，19.6%，19.8%。结果表明，按照上述优选 的最佳工艺参数进行脱脂处理，脱脂 1 次即可将 油脂脱除干净，且随着脱脂次数的增多，有效成 分含量有降低趋势；综合考虑，确定石蜡脱脂次数为 1 次。

根据药物性质和实际 实验条件，分别选择低温冷藏法、乙醇沉淀法和 固体石蜡法进行了预实验考察。结果发现，低温 冷藏法脱脂效果差，不能达到彻底去除；乙醇沉 淀法对有效成分(天龙小肽)的损失较多；而固体石 蜡法充分利用石蜡热熔冷凝、亲油疏水的特性， 工艺操作简便易行、成本低、周期短、脱脂效果 较好，因此对固体石蜡法脱油脂进行了重点研究。 实验中发现，固体石蜡在加入热酶解液前宜加工 成细粉，便于其迅速熔化，避免熔化不均匀现象， 降低除脂效率；另外，在石蜡完全熔化与酶解液 充分混匀后冷却至室温的过程中，严禁搅拌，否 则石蜡层会疏松黏软，冷凝不完全，不仅除脂效 果差，而且会有石蜡残留。

本研究采用福林酚比色法(又称 Lorry 法)测定 天龙仿生酶解液中总小肽的含量，其测定原理是蛋白质或多肽与碱性铜溶液中的 Cu2+络合形成铜蛋白质/多肽复合物，此复合物与福林酚试剂反应， 产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长 650 nm 处 的吸光度与蛋白质/多肽中的酪氨酸和色氨酸的含 量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品中 蛋白质/多肽的含量。研究表明，福林酚试剂只有 在酸性条件下稳定，而铜-蛋白质/多肽复合物的显 色反应在碱性条件下进行，因此，实验中加入福 林酚试剂后应立即充分混匀，否则显色能力会下 降，从而影响测定结果。另外，实验所用碱性铜 溶液要现用现配，否则容易出现沉淀，影响实验结果。