技术分析不同剂型扶正方的差异化学成分(KQ-500

中医认为肿瘤的发生与邪正盛衰，阴阳气血津 液失调等因素密切相关，正气不足是肿瘤发生的前 提条件，邪气距之是肿瘤发生的重要原因，针对肿 瘤患者的临床表现，顾及手术、放化疗对人体的损 害，我院临床医生提出以扶正和祛邪为两大基本原则，总结出以太子参、茯苓、陈皮、甘草等 12 味中药 组成的协定处方“扶正方”。

1 材料

1． 1 仪器

Ultimate 3000 HPLC 高效液相色谱仪 ( 美国 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Q-Exactive Orbitrap /MS 四级杆轨道阱质谱( 美国 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Compound Discovereru 处理软件( 美 国 Thermo Fisher Scientific 公司) ; SIMCA-P 13． 0 多 元统计分析软件( 瑞典 Umetrics 公司) ; Anke TGL16B 离心机( 上海安亭科学仪器公司) ; BSA224S 电 子天平( 德国 Sartorius 公司) ; 昆山舒美KQ-500B 型超声波清 洗器( 昆山市超声仪器有限公司) 。

1． 2 试药

乙 腈、甲 醇、超 纯 水( 德 国 Merck 公 司) ; 甲酸、L-2-氯苯丙胺酸( 美国 Sigma-Aldrich 公 司) 。收集“扶正方”传统中药饮片( 苏州天灵中药 饮片有限公司，批号 190120010) 和配方颗粒( 江阴 天江药业有限公司，批号 18120411) 样品各 5 份。 所有样品均由南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为各自种属药材，留样凭证保存于江南大学附 属医院( 无锡市第四人民医院) 中药房。

2 方法

2． 1 供试品溶液的制备

传统扶正方中药饮片: 按扶正方配伍量( 太子参、茯苓、南沙参、北沙参、麦 冬、天花粉、生白术、生黄精、酒女贞子、淫羊藿均为 10 g、陈皮 6 g、甘草 3 g) ，精密称取饮片，加 8 倍量 的蒸馏水浸泡 30 min，武火煮沸后改文火再煎 20 min，趁热滤出药液，药渣再加相当药材量 6 倍量的 蒸馏水，煮沸后文火再煎煮 30 min，滤过，合并滤液， 蒸干。残渣加入 800 μL 甲醇和 10 μL 内标( 2． 8 mg ·mL － 1，二氯苯丙氨酸) ，置于组织研磨仪中 65 Hz 研磨 90 s，随后 40 kHz 冰浴超声 30 min，在 － 20 ℃ 下静置1 h，以12 000 r·min － 1离心15 min( 置于4 ℃ 离心机中) ，取上清液，过 0． 22 μm 微孔滤膜，即得。 扶正方配方颗粒: 按扶正方配伍量( 太子参 1． 5 g、茯苓 1 g、陈皮 1 g、南沙参 2 g、北沙参 2 g、麦冬 3 g、天花粉 1 g、甘草 0． 5 g、生白术 3 g、生黄精 4 g、酒 女贞子 1 g、淫羊藿 0． 5 g) ，精密称取各配方颗粒，混 合均匀，加适量沸水溶解后稀释至与传统扶正方中 药饮片水煎液相同体积，之后制备方法同上。

2． 2 测定条件

色谱条件: 色谱柱: Hyper gold C18 色谱柱( 100 mm × 2． 1 mm × 1． 9 μm) ; 流动相: 水 + 5% 乙腈 + 0． 1% 甲酸( A) 和乙腈 + 0． 1% 甲酸( B) ; 梯度洗脱程序: 0 ～ 1． 5 min( 100% ～ 80% A) ，1． 5 ～ 9． 5 min( 80% ～ 0% A) ，9． 5 ～ 14． 5( 0% ～ 0% A) ， 14． 5 ～ 14． 6 ( 0% ～ 100% A) ，14． 6 ～ 18 ( 100% ～ 100% A) ; 流速 0． 35 mL·min － 1 ; 柱温 40 ℃ ; 进样量 10 μL。 质谱条件 电喷雾离子源( ESI) ，在正离子模式 下数据采集范围 m / z 50 ～ 1 000，加热器温度 300 ℃ ; 鞘气流速: 45 arb; 辅助气流速: 15 arb; 尾气流 速: 1 arb; 电喷雾电压: 3． 0 kV; 毛细管温度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，30% 。在负离子模式下数据采集 范围 m / z 50 ～ 1 100，加热器温度 300 ℃ ; 鞘气流速: 45 arb; 辅助气流速: 15 arb; 尾气流速: 1 arb; 电喷雾 电 压: 3． 2 kV; 毛 细 管 温 度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，60% 。

2． 3 数据处理与统计分析

采用 Compound Discoverer 软件对 LC /MS 检测数据进行提取和预处理， 并在 Excel 2010 中对数据进行归一化及后期编辑， 最后整理成二维数据矩阵形式，包含保留时间、分 子量、峰强度等信息。将编辑后的数据矩阵导入 SIMCA-P 13． 0 软件进行多元统计分析。采用 PCA分析通过初步观察各样品的聚集情况，直观地表达 不同剂型扶正方之间的化学组成差异; 随后采用 PLS-DA 和 OPLS-DA 进一步对样品进行分类，其中 判别模型质量好坏的主要参数为 Ｒ2 Y( 该值为模型 的解释率) 及 Q2 值( 该值为模型的预测率) ，Ｒ2 Y 越 接近 1，表示模型越稳定，Q2 ＞ 0． 5 表示预测率高。 根据 OPLS-DA 模型的常用变量载荷评价参数 ( VIP) ( VIP ＞ 1) ，并结合 t-test 的 P 值( P ＜ 0． 05) 来 寻找差异性表达代谢物。

3 结果

采用的 PCA 多变量模式识别方 法对传统中药饮片和配方颗粒扶正方进行降维分 析。不同剂型扶正方在质谱正、负离子模式下 PCA 得分散点图，见图 2 ( 正离子模式下，Ｒ2 X = 0． 824， Q2 = 0． 633; 负离子模式下，Ｒ2 X = 0． 811，Q2 = 0． 661) 。结果显示在正、负离子模式下，不同剂型扶 正方之间均具有很好的区分度，这表明传统中药饮 片和配方颗粒扶正方的化学成分存在明显差异。通过排列试验随机多次( n = 200) 改变分 类变量 y 的排列顺序得到相应不同的随机。从图 3b 和 3d 可见，PLS-DA 模型排列实验中左端随机排 列产生的 Ｒ2 和 Q2 值均小于右端的原始值，表明原 始模型的预测能力大于随机排列 y 变量的预测能 力，即模型有效，可以进行后续的差异成分分析。

4 讨论

本实验供试品溶液制备分别考察了 100% 甲醇、 70%甲醇、50% 甲醇、30% 甲醇 4 种溶剂对实验结果 的影响，同时考察了 15，30，45，60，75 min 超声提取时 间，结果表明，以100%甲醇作为溶剂的色谱峰形最优 且超声提取 30 min 的相对峰面积最大。因此，最终 选择这种样品处理方法。流动相的选择分别考察了 甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0． 1% 甲酸水、乙腈-0． 1% 甲酸水、乙腈 + 0． 1% 甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸、5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸，结果表明 5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸的峰形较好且分 离度较高，因此将其确定为流动相。



 

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