紫花杜鹃药材中黄酮类成分的含量测定-KQ-250B使用

紫花杜鹃为杜鹃花科植物紫花杜鹃（Rhododendron mariae Hance）的干燥叶或带叶嫩枝，味微辛、性微 温，广泛分布于广东省岭南、罗定、高要，云南丽江以 及四川宝兴等地区。紫花杜鹃包含挥发油、黄酮、有 机酸、萜类、酚类、鞣质等活性成分 ，其中黄酮类成 分药用效果显著。研究表明，紫花杜鹃的黄酮类 物质具有祛痰止咳、杀菌消炎、镇痛的效果，故在 单方和中药复方制剂中都有广泛的应用。目前以紫 花杜鹃入药的中成药很多，如紫花杜鹃片、紫花杜鹃 胶囊、祛痰止咳颗粒、祛痰止咳胶囊等，临床上对慢性 支气管炎有显著的治疗效果。

1　仪器与试药

1.1 仪器　

Agilent 1220 高效液相色谱仪（安捷伦公 司）；BS 124S 十万分之一电子天平（Sartourius 公司）； 昆山舒美KQ-250B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药　

对照品槲皮素（批号 100081-200406）、 槲皮苷（批号 111538-200302）、金丝桃苷（批号 111521- 200305）、芸香苷（批号 100080-200306）均购自中国 食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水；其他试剂 均为分析纯。实验所用紫花杜鹃药材（编号 1~15） 于 2017 年 4 月至 6 月采自不同产地，由吉林省中医 药科学院赵全成教授鉴定均为正品。

2　方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相 A 相为 0.2% 磷酸水，B 相为乙 腈溶液，梯度洗脱（0~15 min，90%A；15~25 min， 90%A → 85%A；25~35 min，85%A → 80%A；35~50 min，80%A → 70%A；50~60 min，70%A → 65%A； 60~70 min，65%A → 60%A）；流速为 1.0 mL·min-1 ； 检测波长为 254 nm；柱温为 30 ℃；进样量为 10 μL。 色谱图见图 1。

2.2 对照品溶液的制备　

精密称取对照品芸香苷 10.10 mg、金丝桃苷 10.80 mg、槲皮苷 10.05 mg 和槲 皮素 5.15 mg，分别置 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定 容至刻度，得单一对照品储备液；分别精密量取芸香 苷对照品储备液 0.5 mL，金丝桃苷对照品储备液 1.0 mL，槲皮苷对照品储备液 3.0 mL，槲皮素对照品储备 液 0.4 mL，置同一 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度， 制得每 1 mL 含芸香苷 0.010 1 mg、金丝桃苷 0.021 6 mg、槲皮苷 0.0603mg 和槲皮素 0.0041mg 的混合对 照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备　

取样品（过 40 目筛）0.5 g，精密称定，置 50 mL 量瓶中，加入甲醇约 40 mL，超 声（功率 250W，频率 40 kHz）提取 30 min，放至室 温，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系考察　

分别精密量取混合对照品溶液 2、4、8、12、16、20µL 进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进 样量 X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。 芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素的回归方程分别为 Y=2.638×103 X-1.73 r=0.999 6 Y=3.209×103 X-3.54 r=0.999 9 Y=2.100×103 X+11.43 r=0.999 5 Y=4.079×103 X-3.77 r=0.999 0线性范围分别为0.0202~0.202μg、0.0432~0.432μg、 0.120 6~1.206 μg、0.008 2~0.082 μg，各成分进样量与 峰面积呈线性关系。

2.5 精密度试验　

取供试品溶液（2 号样）10 µL，连 续进样 6 次，记录峰面积并计算，芸香苷、金丝桃苷、 槲皮苷、槲皮素峰面积的 RSD 分别为 0.95%、0.54%、 0.72%、1.0%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

精密量取供试样品（2 号样）6 份，按 照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件规定进样 测定其峰面积，计算芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷及槲皮素 的含量分别为 0.147%、0.265%、0.894%、0.020%，RSD 分 别为 0.93%、0.57%、0.69%、1.0%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验　

取供试品（2 号样），按照“2.3”项 下方法制备供试品溶液，分别于 2、4、8、16、24、48 h 进行测定，记录峰面积，计算芸香苷、金丝桃苷、槲皮 苷及槲皮素的含量，结果芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、 槲皮素含量的 RSD 分别为 0.91%、0.56%、0.69%、 1.0%，表明供试品溶液在 48 h 内稳定。

3　讨论

3.1　分析方法确定　

由于紫花杜鹃中成分具有多 样 性，单 一 浓 度 甲 醇 - 水、乙 腈 - 水 不 能 将 有 效 成 分峰理想分离，所以经过多次试验择优，本实验以乙 腈 -0.2% 磷酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱，样品 中芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素达到基线分离； 采用 254 nm 为检测波长，使样品中的目标峰和杂质 峰完全分离；由于芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素 为黄酮类的低极性化合物，故选用不同浓度乙醇和甲 醇对提取溶剂进行考察，结果表明甲醇提取效果更 好；同时采用超声和回流 2 种提取方法对提取方法 进行了考察，实验结果表明，两者提取效率接近，无明 显差别，考虑到超声提取操作简单，故此选择超声提 取；提取时间考察结果表明，在 30 min 内目标化合物 已充分溶解。

3.2 结果分析　

本实验对不同产地和不同采收期的 紫花杜鹃干燥叶及嫩枝中的芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素进行含量测定，通过实验看出，不同产地 的芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素含量明显不同， 同一采收期药材广东罗定的含量最高，云南丽江的 含量最低，5 月份槲皮苷变化最为明显。不同采收 期实验结果表明，广东 3 个地区的 5 月份采收的紫 花杜鹃中 4 个成分的含量最高，云南丽江及四川宝 兴 6 月份采收的紫花杜鹃中 4 个成分的含量最高， 推测可能由于地区间的差异，使开花期延后所致，说 明紫花杜鹃在花开始开放还未完全开放时有效成分 的含量最高，可以为紫花杜鹃的采收期的确定奠定 基础。 本研究采用建立的含量测定方法对含紫花杜鹃 药材的中成药进行 4 个黄酮成分的含量测定研究，实 验结果表明，本方法适合于含紫花杜鹃药材的中成 药的含量测定，其分离度、耐用性等均符合规定。本实验结果可以为紫花杜鹃药材的质量控制研究奠定 基础。