昆山舒美测定双黄连可溶性粉中3个成分的含量

双黄连可溶性粉质量标准收载于《兽药质量标准》2017 年版（中药卷）非处方药，由金银花、黄芩、连翘 3 味中药 组成，兽医临床用于预防和治疗畜禽外感风寒所致的上呼 吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎和轻度肺炎等。 现行标准中仅有黄芩中黄芩苷的含量测定，但中药复方具 有多成分、多功效的作用特点，测定单味中药成分难以表 达中药复方的整体质量。在相关文献的基础上，笔者等 以这 3 种药材的代表性成分为检测指标，采用 HPLC 波长 切换法对制剂中金银花、黄芩、连翘的 3 个特征性成分绿原 酸、连翘苷、黄芩苷进行含量测定，该方法简便，分离度好， 结果准确，适用于双黄连可溶性粉的产品质量控制分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 戴安高效液相色谱仪，戴安二极管阵列检测 器；Mettler XS105 十万分之一天平（梅特勒公司）；Sartorius BP211D 电子分析天平 （德国赛多利斯）；KQ－500E 型超 声 波清洗器 （昆山舒美超声仪器有限公司）；手动移液器 （Eppendorf，德国）。

1.2 试药

对照品绿原酸（批号：Z0261702，规格：98.3%）购自中国兽医药品监察所；连翘苷（批号：11082-200615，规格：94.9%） 购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷（批号：Z0271514，规 格：95.9%）购自中国兽医药品监察所；甲醇（色谱纯级）购自 德国 Merck 公司；水为超纯水；磷酸为分析纯；双黄连可溶性 粉由安徽省相关兽药企业提供，分别为 A 企业 （批号： 20181011）、B 企 业 （批 号 ：20180625）、C 企 业 （批 号 ： 20180712）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验

采用 Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流动相为甲醇（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），按表 1 程序进 行梯度洗脱，流速 1 mL/min，检测波长分别为 326 nm （0 ～26 min，测定绿原酸）、230 nm（44～48 min，测 定 连 翘 苷）、277 nm（48～53 min，测定黄芩苷），柱温 30 ℃，进样 量 10 μL。在上述色谱条件下，3 种待测成分与邻近组分满 足分离条件，各对照品的理论塔板数均大于 3 000。色谱 图及光谱图见图 1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液

精密称取原酸、连翘苷、黄芩苷的 对照品适量，分别加甲醇配制成每 1 mL 含绿原酸 4.53 mg、 连翘苷 2.78 mg、黄芩苷 28.52 mg 的对照品储备液。

2.2.2 混合对照品溶液

精密吸取绿原酸对照品储备液 1 000 μL，连翘苷对照品储备液 1 000 μL，黄芩苷对照品 储备液 1 000 μL，置 5 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻 度，摇匀，得浓度为绿原酸 45.3 μg/mL，连翘苷 27.8 μg/mL， 黄芩苷 219.0 μg/mL 的混合对照品溶液，冷藏，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备

取双黄连可溶性粉研细的粉 末 0.5 g，精密称定，置 50 mL 的容量瓶中，加 50%甲醇适 量，超声提取（功率 250 W，频率 40 kHz）20 min，冷却至 室温，加 50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤 液 5 mL，置 10 mL 量瓶中，加 50%甲醇稀释至刻度，摇 匀，即得。 2.2.4 阴性样品溶液的制备 按工艺方法分别制备缺少金银花、连翘和黄芩的阴性样品，并按“2.2”项下的方法， 制得阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及缺金银花、 缺连翘、缺黄芩的阴性对照溶液各 10 μL，在上述色谱条 件下分别注入色谱仪，双黄连可溶性粉在与绿原酸、连翘 苷、黄芩苷对照品相应的位置上均有相同保留时间的色谱 峰，而缺金银花的阴性对照溶液无绿原酸色谱峰，缺连翘 的阴性对照溶液中无连翘苷色谱峰，缺黄芩的阴性对照溶 液无黄芩苷色谱峰，说明双黄连可溶性对各成分的测定不 产生干扰。

3 讨论

在处理样品的溶剂选择上，分别选择 50%甲醇、75% 甲醇、纯甲醇以及不同比例的乙醇溶液进行样品处理，试 验结果显示，50%甲醇提取的双黄连可溶性粉中的 3 种成 分的响应值最高。同时，分别选择超声、回流 2 种提取方法 进行样品处理，结果显示超声提取效率最高，并且简便快 捷。在超声提取时间上，分别选择 10 min、15 min、20 min、 30 min、45 min 对双黄连可溶性粉进行超声提取，试验结 果显示样品在超声 20 min 提取效率达到最高，20 min 后 的超声提取对试验结果值影响不显著。因此，选择用 50%甲醇超声 20 min 提取效果最佳。中药成分复杂而呈多样性，本文采用二极管阵列检测 器在 200~400 nm 范围内对 3 种成分进行光谱扫描，结果 显示绿原酸、连翘苷、黄芩苷的光谱图存在一定差别，用同 一波长下同时检测 3 种成分，难以获得理想的灵敏度，笔 者参考有关文献利用二极管阵列检测器的全波长扫描功 能和波长切换功能，扫描绿原酸、连翘苷、黄芩苷这 3 种成 分在 200～400 nm 波长范围内的光谱图谱，同时结合流动 相的梯度洗脱将这 3 种成分进行分离，通过样品的光谱和 色谱信息将波长设定为 0～26 min 时 326 nm （测定绿原 酸），40～43 min 时 230 nm （ 测定连翘苷），43～46 min 时 277 nm （测定黄芩苷）。运用本方法分别在各组分的出峰 时间段选择相应的最大吸收波长作为检测波长，提高了检 测的灵敏度，实现了 3 个待测成分含量的同时测定。