昆山舒美浅谈加参片提取物入血成分

慢性心力衰竭( chronic congestive heart failure，CHF) 是 大多数心血管疾病的最后归宿和死亡原因，发病率也逐年 上升，我国已达 0． 9% ，老年人群的发病率达 1． 3%。 且老年心力衰竭患者的住院时间长，再入院率高，生活质量 差。虽然 CHF 的住院率占同期心血管病的 20% ，但死亡率 却占 40%，提示其预后的严重性，情况不容忽视。加参 片处方来源于临床经验方。

1 仪器与材料

1． 1 仪器

超高效液相色谱系统 ACQUITY UPLC ( 美国 Waters 公 司) ，PDA 检 测 器 ( 美 国 Waters 公 司) ，Waters Q － TOFPremier 质谱仪( 英国 Waters MS Technologies 公司) ，数据 处理软件为 MasslynxTM4． 1 和 Metabolynx( 美国 Waters 公 司) ; Mettler Toledo XS205 分析天平( 瑞士 Mettler Toledo 公 司) ; KQ-500DE 型数控超声波清洗仪( 昆山舒美超声仪器有限公司) ; Milli － Q 超 纯 水 系 统 ( 美 国 Millipore 公 司) ; ST16Ｒ 高速冷冻离心机( 美国 Thermo 公司) 。

1． 2 材料

试剂: 甲醇( 质谱级，德国 Merck 公司) ，乙腈( 质谱级， 德国 Merck 公司) ，乙酸乙酯( 色谱级，天津市康科德科技 有限公 司) ，甲 酸 ( 色 谱 级，德 国 Merck 公 司) ，超 纯 水 ( Milli － Q 制备) ，肝素钠( 160 μ/mg，南京奥多福尼生物科 技有限公司) 。试药: 加参片提取物( 批号 20161103，天士 力研究院现代中药研发中心提供) 。动物: 雄性 Wistar 大 鼠，体质量( 200 ± 20) g，购自北京维通利华实验动物技术 有限公司。

2 方法

2． 1 色谱与质谱条件

2． 1． 1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 ( 2． 1 mm × 100 mm，1． 7 μm) 。流动相 0． 1% 甲酸水( A) － 甲醇( B) ; 梯度洗脱: 0 ～ 3 min，10% ～ 10% B; 3 ～ 11min， 10% ～ 20% B; 11 ～ 21 min，20% ～ 40% B; 21 ～ 35 min， 40% ～ 70% B; 35 ～ 37 min，70% ～ 95% 。流速 0． 3 mL· min － 1 ; PDA 全波长扫描; 柱温 30 ℃ ; 进样量 2 μL。

2． 1． 2 质谱条件

采用电喷雾离子化源( ESI) ，MSE 扫描 正负离子模式检测，扫描范围 m/z50 ～ 1500，用亮氨酸脑啡 肽作校正液，进行实时校正。毛细管电压负离子模式 2． 3 kV，正离子模式 2． 8 kV，锥孔电压为 40 V，雾化气为高纯度 氮气，流速为 50 L/h，碰撞气为氩气，脱溶剂气流速 800 L/ h，脱溶剂温度为 350 ℃，离子源温度为 120 ℃。高能量扫 描时 trap 电压为 20 ～ 60 eV。

2． 2 灌胃液制备

按照加参片中药材提取工艺对各药材进行提取，其中丹参、香加皮、黄芪、三七采用稀醇提取大孔树脂纯化等技 术制备提取物，桂枝、益母草等采药材用水提醇沉等技术得 到提取物，经现有的内控质量标准检验为制备加参片制剂 合格的加参片提取物，按比例混合。取加参片全方提取物 2． 758 g，缺香加皮阴性提取物 2． 64 g，香加皮提取物 0． 122 g，各 加 10 mL 二 纯 水 溶 解，制 得 浓 度 分 别 为 0． 275 8， 0. 264，0． 012 2 g /mL 的供试品溶液。

2． 3 血浆样品的制备

Wistar 大鼠适应 1 周后，将 8 只大鼠随机分为 4 组，3 个给药组( 加参片提取物全方组、缺香加皮阴性提取物组、 香加皮提取物组) 每组 2 只，空白组 2 只。实验前禁食 24 h，自由饮水，给药组分别以 4． 137、3． 95、0． 183 6 g /kg( 均基 于预实验结果确定) 的给药量灌胃加参片提取物全方提取 液，缺香加皮阴性提取物提取液，香加皮提取物提取液，分 别在 5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1． 5 h、2 h、3 h、5 h、7 h 眼静脉从采集血液各 500 μL，血液置于含有肝素钠的 EP 管中，4500 r/min 离心 10 min ，取上清液血浆。各点各取 150 μL，加 4 倍量甲醇，涡旋振荡 2 min，离心 15 min( 4 ℃， 14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃氮气吹干，再加入 100 μL 初 始流动相复溶( 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超声 1 min，涡旋振荡 2 min，离心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液转移至液 相内插管中待用分析。

3 结果

含药血浆、空白血浆各进样 4 μL，按 2． 1 项下的色谱 与质谱条件进样分析，采用 MSE 扫描正负离子检测，获得 的正、负离子模式下的 BPI 图通过色谱保留时间、质谱准分子离子峰信息( MS) 、碎 片离子信息( MS /MS) ，及在加参片提取物 化学成分研究的基础上，共指认出 14 个入血原型成分 ( 表 1) ，5 个代谢产物。M2、M3: 负离子模式下，在 m/z 459． 09 的提取流色谱 图中，可以检测到两个代谢产物的色谱峰，保留时间分别为 20． 337 min( M2) 和 25． 675 min( M3) 。其中 M2 的二级质 谱中出现 m/z 459． 091 7，m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2， m/z 175． 019 0 等一系列碎片离子，体外样品溶液毛蕊异黄 酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖苷也出现 m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2 的碎片离子，毛蕊异黄酮的［M － H］－ 分子离子 m/z 283． 057 8 比 m/z 459． 092 2 多 176 Da，M3 的二级碎片也存在 m/z 283． 057 3，m/z 269． 040 6，m/z 175． 008 8 的碎 片离子，且 M2 的峰面积大于 M3，依据碎片离子信息推断 M2 为毛蕊异黄酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖 醛酸，M3 为毛蕊异黄酮 － 3’－ O － b － D － 葡萄糖醛酸( m/ z 175． 019 0 是葡萄糖醛酸的特征离子峰) 。

4 讨论

课题组前期进行的加参片提取物化学成分研究中， 所开发的方法在入血成分分析中仍然适用，所以本实验所 采用的色谱与质谱方法同前期开发加参片提取物化学成分 方法一致。给药血浆各采血点各取 20 μL 血浆 混合，加入 4 倍量甲醇，涡旋振荡 2 min，离心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃ 氮气吹干，再加入 100 μL 初始流动相复溶( 0． 1% 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超声 1 min， 涡旋振荡 2 min，离心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液 转移至液相内插管中，采用液质联用技术分析检测。以峰个数、分离度、峰面积的大小等因素来确定血浆处 理方法。由图 3 可以看出，乙酸乙酯萃取处理法，出峰个数 较少，其更适用于中等极性或者弱极性的成分，而对极性较 大的成分选择能力较弱。基于加参片提取物前期化学成分 的研究，方中极性成分占多数，故舍弃乙酸乙酯萃取法。 有机溶剂甲醇沉淀法，出峰个数较多，富集度高，分离效 果也较好，且得到的峰面积较乙腈沉淀法和甲醇乙腈沉 淀法高，最终确定用甲醇沉淀法作为血浆的前处理方法。



 

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