KQ100DB对于灯盏花及提取物中灯盏花乙素含量的使

灯盏花主要产于云南、广西、贵州 等地，又称灯盏细心，为菊科植物短葶飞蓬的干燥全 草，其主要成分为黄酮类化合物，有效成分为灯盏花 乙素。具有清除活性氧自由基、溶解血栓、增强 脑部血液流动和降低血管阻力等作用，临床上多用于治疗心脑血管等疾病。作为国家重点开发 的中药材，灯盏花在云南丽江、红河等地实现大规模种植。

灯盏花药材由云南易思高生物科技有限公司提 供; 灯盏花乙素对照品购自上海麦克林生化科技有 限公司; 乙醇、( NH4 ) 2 SO4、H3PO4、NaCl、Na2CO3、 Na2 SO4 Na3PO4 和 NaOH 均为分析纯，甲醇为色谱 纯、水为超纯水。

KQ100DB 型超声波清洗仪( 昆山市超声仪器有 限公司) ; pH 计( 雷磁 PHS-3C) ; FA1004 型万分之 一分析天平( 上海恒平科学仪器有限公司) ; HC3018Ｒ 高速冷冻离心机( 安徽中科中佳科学仪器有 限公司) ; 德国 IKA Lab Dancer 小舞灵漩涡混匀器。 Agilent 1260 高效液相色谱仪 ( 配备四元泵、 VWD 检测器、自动进样器、柱温箱) ，色谱条件: Agilent TC-C18 色谱柱( 4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动 相为甲醇 － 0． 1 % 磷酸溶液( 40∶ 60) ，检测波长为 335 nm，流速为 1 mL /min，柱温箱为 25 ℃。

将干燥后的灯盏花 全草打粉至 80 目，取细粉 0． 1 g( 精密称定) ，将其 置于 25 mL 具塞离心管中，加入 10 mL 甲醇，密塞， 称重，超声 1 h，放冷称重，甲醇补足重量。然后于 4000 r/min 离心 10 min，取上清液，加水稀释至 50 mL，作为灯盏花乙素粗提液。

考虑双水相 体系的性质，选择乙醇作为提取溶剂。取 10 mL 灯 盏花乙素粗提液至 15 mL 离心管中，加入一定量的 ( NH4 ) 2 SO4 和无水乙醇，调 pH 值至 6，涡旋 1 min， 使其充分混合。然后以4000 r/min 离心5 min，促使 其分相。下层即为盐相，上层为乙醇萃取相。读取 上下层体积之后( 相比 = 萃取相体积/水相体积) ， 用注射器移除下层水相。为防止萃取相中存在的盐 对高效液相色谱仪造成腐蚀，萃取相中加甲醇 0． 5 mL 进行脱盐处理，最后甲醇定容至 2 mL，过 0． 45 μm 有机相滤膜之后，取 10 μl 进 HPLC 进行分析。

采用 HPLC 法测定灯盏花粗提液中灯盏花乙素含量。根据灯盏花乙素 标准曲线计算其浓度，然后再按下式计算灯盏花乙 素含量( % ) :

Ｒ( % ) = (Cu × Vu / m) × 100

式中，Ｒ 为萃取效率( % ) ; Cu 为灯盏花乙素在萃取 相中的浓度( mg /mL) ; Vu 为萃取相的体积( mL) ; m 为称取的灯盏花粉末的质量( mg) 。

所使用的乙醇能与水完全互溶，通过乙醇 － 水 体系统加入( NH4 ) 2 SO4，利用盐析作用，促进乙醇与 水相的分离。双水相体系的形成是( NH4 ) 2 SO4 与 乙醇争夺水分子的过程，随着盐浓度的增大，盐会夺 取水分子，促使乙醇从盐相析出，使水分子离开乙醇 相，最终出现分相，上层为乙醇相，下层为盐水相。 为研究不同条件下，双水相体系中乙醇相的变化，通 过以下公式计算相比 Ｒv ∶ Ｒv = Vend ∶ Vin，式中，Vend为 乙醇相的体积，Vin为加入的乙醇的初始体积。当 Ｒv 趋近于 1 时表示乙醇与水完全分离。灯盏花乙素属于黄酮类化合物，分子中含有多 个酚羟基和羰基，在 pH 较高和较低情况下，会发生 酚羟基氢离子的电离和羰基的质子化，最终变成大 极性离子。由于酚羟基的存在，灯盏花乙素相当于 多元弱酸，一般会以质子化阳离子形态、分子形态和 失质子化阴离子形态存在。根据相似相溶的原理， 弱极性的分子形态灯盏花乙素易富集于乙醇相中， 而大极性离子形态的灯盏花乙素则易于分配在水相 中。因此，溶液酸碱度对灯盏花乙素的分配起很重 要作用。分子形态的灯盏花乙素结构上的酚羟基和 羰基与乙醇羟基之间的氢键也非常有利于提高灯盏 花乙素的分配比，使其易富集于乙醇中。乙醇加入量为 1． 5 mL，保持其他实验条件不 变，分别考察盐质量分数为 5 % 、8 % 、10 % 、15 % 、 20 % 、25 % 和 30 % 时对萃取率的影响。在盐质量分数小于 8 % 时，溶液无法形成双水 相，当盐质量分数大于 8 % 时，随着盐质量分数的增 加，萃取率逐渐增加，当( NH4 ) 2 SO4 质量分数为 25 % 时 萃 取 率 最 高 为 93． 4 % 。故 研 究 中，确 定 ( NH4 ) 2 SO4 最优质量分数为 25 % 。在保持乙 醇的用量为 1． 5 mL 和盐的质量分数为 25 % 的条件 下，调节体系的 pH 值在 3 ～ 9，如图 4 所示。pH 值 为 3 ～ 6 时，灯盏花乙素的萃取率逐渐升高，pH 值为 6 时，萃取率最高为 94． 3 % 。当 pH 值大于 7 时，灯 盏花乙素的萃取率较低。究其原因灯盏花乙素在弱 酸性条件下呈分子状态，极性较小，在乙醇中的分配 比更大。当溶液 pH 值较低时灯盏花乙素上的羰基 会被质子化，pH 值较高时氢离子又会被电离，都会 形成极性较大的分子，分配比较低。故选择 pH = 6． 0 为最优条件。

在前人研究中，昆山舒美认为多使用 95 % 乙醇或三氯甲烷作为提取液，回流提取灯盏花乙素，然后提取液经 过旋蒸等方法浓缩，甲醇定容后进行分析。也有通 过大量甲醇超声提取灯盏花乙素，进行检测。该 方法使用甲醇提取之后，通过双水相方法富集提取 液，简单快速、准确性高，并且所使用的双水相体系 绿色 环 保、易 于 放 大 研 究。 本 研 究 以 乙 醇 与 ( NH4 ) 2 SO4 制备双水相体系，利用双水相萃取提取 灯盏花乙素粗提液中的灯盏花乙素，并最终对灯盏 花乙素含量进行测定，研究表明双水相体系具有良 好的净化性能，能有效降低灯盏花提取液中的大分 子物质和极性分子的干扰。研究结果为灯盏花中灯 盏花乙素的提取、含量测定提供了一种绿色环保、简 单有效的方法。

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