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牛膝是苋科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl. 的 干燥根，产于我国南温带亚湿润气候区，黄河以 北、海拔 200 m 以下的冲积平原最适宜栽培，其传 统产区为河南焦作（古怀庆府），当地已有 2000 多年 的栽培历史，所产牛膝条子粗壮、明亮、色泽鲜 艳、油性大，加上广大药农在长期的生产实践中积 累了丰富的栽培经验，创造了独特的加工技术，成 就了道地药材怀牛膝。现在怀牛膝产区逐步外延， 在国内形成三大牛膝产区：内蒙赤峰牛营子镇，河 北安国市周边，河南武陟大虹桥、大封镇和温县赵 堡镇。牛膝主要化学成分包括三萜皂苷类、甾酮 类、多糖类、黄酮类等，药理作用包括抗骨质疏 松、改善血液循环、抗动脉粥样硬化、促进神经生 长、改善糖代谢等 。
1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技 有限公司）；MS204S 万分之一分析天平、XP205 十 万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；电子天平（赛多利斯）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公 司）；LGJ-12 低温冷冻干燥仪（北京松源华兴科技发 展有限公司）；SB-1100 旋转蒸发仪、A-1000S真空泵（日本东京理化器械株式会社）。
β-蜕皮甾酮对照品 （批号：111638-201706，纯度：98.4%）、牛膝对照 药材（批号：121066-201508）、人参皂苷 Ro 对照品 （批号：111903-201604），中国食品药品检定研究 院。试剂乙腈、甲醇为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏 水；其他试剂均为分析纯。
16 批牛膝饮片（S1~S16）来源：河北安国 （S1~S3）、河南武陟（S4~S10）、河南孟州（S11~S13）、 内蒙赤峰（S14~S16），经广州中医药大学王洛临主任 中药师鉴定，均为苋科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl. 的干燥根。由本实验室根据《中药配方颗粒质量控 制与标准制定技术要求》（征求意见稿）制备牛膝的标 准汤剂。另取内蒙赤峰饮片（S14~S16）分别制备 3 批 配方颗粒样品。
标准汤 剂：根据 《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术 要求》 和国家中医药管理局 《医疗机构中药煎药室 管理规范》，称取牛膝，煎煮 2 次。第 1 次加水 9 倍 量，浸泡 30 min，煎煮 30 min，滤过；第 2 次加水 7 倍量，煎煮 20 min，滤过，滤液合并，减压浓缩至 饮片投料量，即浸膏浓度为 1 g·mL-1 ，冷冻干燥，即 得标准汤剂冻干粉。 配方颗粒：取牛膝 2 500 g，煎煮 2 次。第 1 次 加水 8 倍量，煎煮 30 min；第 2 次加水 6 倍量，煎 煮 30 min；滤过，滤液合并，减压浓缩至相对密度 为 1.05～1.10（60 ℃）的浸膏，喷雾干燥，得干膏 粉；加入麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒 1 000 g， 即得。 2.2 TLC 法鉴别牛膝针标准汤剂和配方颗粒中的指 标成分
取牛膝标准汤剂冻干粉和 配方颗粒各约 1 g，加 80%甲醇 50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水 15 mL，微热使 溶解；加在 D101 大孔吸附树脂柱（内径为 1.5 cm， 柱高为 15 cm）上，用水 100 mL 洗脱，弃去水液；再 用 20%乙醇 100 mL 洗脱，弃去洗脱液；继用 80%乙 醇 100 mL 洗脱；收集洗脱液，蒸干，残渣加 80%甲 醇 1 mL 使溶解，即得。
取 β-蜕皮甾酮对照品和人 参皂苷 Ro 对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 分别含 β-蜕皮甾酮 1 mg、人参皂苷 1 mg 的混合对照品溶液。
取牛膝对照药材 2 g， 加 80%甲醇 50 mL，加热回流 3 h。按 2.2.1 项下方法制备对照药材溶液。
按照《中国药典》2015 年版四部通则 （0502），吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品 溶液各 4 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上；以三 氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）为展开剂，展 开，取出晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，在 105 ℃ 加热至斑点显色清晰。结果见图 1、2。以牛膝对照 药材溶液、β-蜕皮甾酮和人参皂苷 Ro 为参照，牛膝 标准汤剂与配方颗粒样品溶液在同一硅胶 G 薄层板 相应位置显相同颜色的荧光斑点。
取 S1~S16 批牛膝饮片粉 末（过 3 号筛）各约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶 中，加水饱和正丁醇 30 mL，密塞，浸泡过夜；超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，滤过；用 甲醇 10 mL 分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗 液，蒸干；残渣加甲醇使溶解，转移至 5 mL 量瓶， 加甲醇至刻度，摇匀，即得。 另取牛膝标准汤剂和配方颗粒样品各约 0.5 g， 精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入甲醇 25 mL， 称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz） 30 min，放冷，称定质量；用甲醇补足减失的质量， 摇匀，滤过，取续滤液，即得。
取 β-蜕皮甾酮对照品适 量，精密称定，加甲醇使溶解制成每 1 mL 含 24.3 μg 的溶液，即得。
采用 Agilent ZORBAX Eclipse C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。 以乙腈-0.1%甲酸水溶液（16∶84）为流动相；检测波 长为 250 nm。理论板数按 β-蜕皮甾酮峰计算应不低 于 4 000。此色谱条件下，供试品溶液中待测指标成 分 β-蜕皮甾酮分离度良好。
精密吸取 β-蜕皮甾酮对照品 溶液 1、2、4、6、8、10 μL，按 2.3.3 项下色谱条件 分别进样测定，以进样量为横坐标（X）、峰面积为纵 坐标（Y），得回归方程 Y=1 647 876.54X－1 557.91，r＝ 1.000 0，β-蜕皮甾酮线性范围为 0.024 3～0.243 0 μg。
取 β-蜕皮甾酮对照品溶液，按 2.3.3 项下色谱条件连续进样 6 次，结果 β-蜕皮甾酮 峰面积 RSD 为 0.65%，表明精密度良好。
取标准汤剂（S1）供试品溶液，分 别放置 0、2、4、6、8、12 h 时，按 2.3.3 项下色谱 条 件 测 定 ， 结 果 β- 蜕 皮 甾 酮 峰 面 积 的 RSD 为 1.29%，说明供试品溶液在 12 h 内稳定。
取标准汤剂（S1）供试品溶液， 按照 2.3.1 项下方法制备供试品溶液，按 2.3.3 项下 色谱条件测定，平行 6 次。结果 β-蜕皮甾酮质量分 数平均值为 0.096%，RSD 为 1.22%，表明该方法重 复性良好。
精密称取牛膝标准汤剂 （S1）样品粉末 0.25 g（β-蜕皮甾酮含量为 0.096%）， 平行 6 份；各加入 β-蜕皮甾酮对照品 0.243 0 mg， 混匀，按 2.3.1 项下方法制备供试品溶液，按 2.3.3 项下色谱条件测定。结果平均加样回收率为 92.34%， RSD 为 1.21%，表明加样回收率良好。 2.3.5 指标成分含量测定 分别取 S1～S16 批牛膝饮 片及其标准汤剂冻干粉、S14~S16 批配方颗粒，按 2.3.1 项下方法制备供试品溶液，按 2.3.3 项下色谱条 件测定，结果见表 1。S1～S16 批饮片 β-蜕皮甾酮含 量为 0.066%，标准汤剂出膏率和 β-蜕皮甾酮含量分 别为 32.906%、0.102%，标准汤剂转移率为 51.82%。 按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》 （征求意见稿），取平均值的 70%～130%分别作为 4 者的变异可接受范围，则各指标范围饮片 β-蜕皮甾 酮含量为 0.46%～0.85%，标准汤剂出膏率 23.03%～ 42.78%，标准汤剂 β-蜕皮甾酮含量 0.071%～ 0.133%， 标准汤剂转移率 36.28%～67.37%。经测定，3 批配方 颗粒（S14~S16）出膏率、β-蜕皮甾酮含量、β-蜕皮甾 酮转移率平均值为 35.45%、0.121%、59.13%，均在 标准汤剂规定值范围内，说明该配方颗粒制备工艺 基本合理。
中药配方颗粒应遵从传统中医药理论，在融合现 代工艺设备基础上尽可能地保留传统汤剂中的主要 成分。为有效控制中药配方颗粒生产各环节的质 量，国家药典委员会《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）提出标准汤剂的概念并 将其作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一 致的标准参照物。按照技术要求，标准汤剂由不少 于 15 批原料药材分别制得，用出膏率、有效或指标 成分的含量测定及转移率、指纹或特征图谱等参数 来表征，以平均值规定变异可接受范围确定限度。 釆用 HPLC 或 GC 指纹图谱技术，加强其专属性鉴别 和整体质量控制。本研究按照上述要求建立基于标 准汤剂的牛膝配方颗粒的质量标准。
