超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶中38种

抗生素主要用于预防和治疗细菌性感染类疾病，促进畜禽健康生长，以提高养殖质量和效率。在 奶牛养殖中，抗生素主要用于治疗乳牛乳腺炎、腹泻等疾病。泌乳期乳牛若过量使用抗生素或休 药期不足，可能导致牛奶中残留抗生素，并通过食物链对人体健康造成不良影响，如引起胃肠不适、 过敏反应、肝功能损害等。此外，滥用抗生素或长期摄入含抗生素食品可能会产生细菌耐药 性，对人类健康危害更加严重，同时，抗生素残留对环境中微生物群落也会产生影响，并通过食 物链影响高级生物，破坏生态系统。为保障食品安全，我国农业部第 235 号公告规定了动物源性食 品中抗生素的最大残留限量( MＲL) ，许多国家及组织也制定了抗生素最大残留限量，限量标准日益 严格。因此，建立一种快速、简便、灵敏的食品中抗生素检测方法十分必要。 目前，抗生素的检测方法主要有微生物法、生 物 传 感 法、酶 联 免 疫 法、液 相 色 谱 法、液相色谱 － 串联质谱法等。但微生物法、生物传感法及酶联免疫法的特异性不高，灵 敏度较差; 液相色谱法存在检测抗生素种类有限、检出限高等缺点。超高效液相色谱 － 串联质谱法 ( UPLC － MS /MS) 因分析效率高、灵敏度高等优势，成为抗生素残留分析的主流检测方法。王浩等利用液相色谱 － 串联质谱在 30 min 内测定了牛奶中 5 类 35 种抗生素残留，李宁等开发了牛奶中 4 类 25 种抗生素残留的检测方法。但已有方法存在操作繁琐、耗时较长、检测抗生素种类或数量相对较 少，以及不适于样品快速筛查分析的不足。抗生素残留问题日渐突出，由此带来的潜在风险引起了社 会公众广泛关注，为确保我国食品和环境安全，探索一种快速、高效、灵敏的多种类抗生素残留同时 测定方法迫在眉睫。 本文以奶牛养殖业中常用的抗生素为研究对象，针对不同种类抗生素理化性质的差异，优化了提 取溶剂和净化条件，考察了基质效应，建立了同时测定牛奶中 5 类( 磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯 霉素类、大环内酯类) 38 种抗生素残留的 UPLC － MS /MS 方法。本方法成功应用于实际牛奶样品中目 标抗生素的测定，可为牛奶中多类别、多组分抗生素的快速筛查提供参考。

Waters Acquity UPLC H － Class Xevo TQ － S 超高效液相色谱 － 串联质谱仪( 美国 Waters 公司) ; 涡 旋振荡器( 德国 IKA 公司) ; HGC － 36A 氮吹仪( 天津恒奥有限公司) ; KQ-500DE 超声仪( 昆山市超声仪器有限公司) ; Anke TDL － 5 － D 离心机( 上海安亭科学仪器厂) ; Milli-Q 超纯水器( 美国 Millipore 公 司) 。 甲醇、乙腈( 均为 HPLC 级，德国 Merck 公司) ; 甲酸( HPLC 级，上海麦克林公司) ; Oasis PＲiME HLB( 60 mg，3mL) 固相萃取小柱( 美国 Waters 公司) ; 磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲 唑、 磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺异 唑、磺胺苯酰、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒 嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺喹 啉、磺胺间二甲氧嘧啶、丹诺沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环 丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奥比沙星、双氟沙星、 喹酸、氟甲喹、四环素、土霉素、强力霉素、金霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、红霉素、罗 红霉素标准物质购于德国 Dr. Ehrenstorfer 公司，纯度均≥98% 。

准确称取各标准物质适量，分别用甲醇溶解并定容至 10 mL，配制成质量浓度均为 1 mg /mL 的单 标储备液; 量取各单标储备液 0. 1 mL 至同一 10 mL 容量瓶中，以甲醇定容并混匀，配制成质量浓度为 10 μg /mL 的混合标准工作溶液，于 － 20 ℃ 下密闭保存。准确移取一定量的混合标准工作溶液，配制 成系列空白样品基质匹配标准溶液，现用现配。

准确称取 1. 00 g 牛奶样品至 15 mL 聚丙烯离心管中，加入 5 mL 0. 5% ( 体积分数) 甲酸乙腈溶液， 涡旋振荡后超声 10 min，以 5 000 r/min 离心 5 min，取上清液，待净化。 Oasis PＲiME HLB 固相萃取小柱经 5 mL 乙腈 － 水溶液( 体积比 1 ∶ 1) 活化平衡后，上样，流速为 1 mL /min，用 5 mL 乙腈 － 水溶液( 1 ∶ 1) 洗脱，收集流出液，在 40 ℃下氮吹近干，用初始流动相溶解并定容至 1 mL，过 0. 22 μm 滤膜后，待 UPLC － MS /MS 分析。

色谱条件: Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d. ，1. 8 μm) ; 流速: 0. 4 mL / min; 柱温: 40 ℃ ; 进样量: 2 μL; 流动相: A 为 0. 1% ( 体积分数) 甲酸水溶液，B 为甲醇。梯度洗脱 程序: 0 ～ 0. 20 min，95% A; 0. 20 ～ 2. 50 min，95% ～ 50% A; 2. 50 ～ 4. 50 min，50% ～ 5% A; 4. 50 ～ 4. 51 min，5%～ 95% A; 4. 51 ～ 8. 00 min，95% A。 质谱条件: 电喷雾离子源( ESI) ; 待测磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素为正离子 模式，毛细管电压: 2. 5 kV; 氯霉素类抗生素为负离子模式，毛细管电压: － 2. 5 kV; 多反应监测模 式( MＲM) 检测; 离子源温度: 150 ℃ ; 脱溶剂温度: 600 ℃ ; 脱溶剂气和锥孔气均为氮气，流速分别 为 1 000、150 L /h; 碰撞气为氩气( 纯度 ＞ 99. 999% ) ，流速为 0. 15 mL /min。其他质谱参数见表 1。

5 类抗生素在不同离子模式下的响应不同，磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素在 正离子模式下响应较强，而氯霉素类在负离子模式下响应较强。因此，本研究选择正、负离子模式同 时监测以提高效率。 考察了 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d． ，1. 8 μm) 和 Acquity UPLC BEH C18色 谱柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d． ，1. 7 μm) 对 38 种抗生素的分离效果。结果显示，经 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱分离后 38 种抗生素的峰形相对更佳，这是由于 HSS T3 柱为硅胶基质色谱柱，适用于较宽极性 范围的物质分析，对于同时分析多种目标物的效果相对较佳。 通过质谱扫描分析，分别对各抗生素进行正离子、负离子扫描，确定各目标物的分子离子，再对 分子离子进行二级质谱扫描( 子离子扫描) ，对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，选择响应强度较 高的子离子为特征离子。设定驻留时间及采集通道，确保色谱峰采集点数在 12 点以上，以得到准确的 定量结果。各抗生素的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量见表 1。

3 结 论

本研究建立了 UPLC － MS /MS 同时测定牛奶中 5 类( 磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类和大 环内酯类) 38 种抗生素残留的分析方法，对提取溶剂、净化方式等因素进行了优化。在最佳条件下， 38 种抗生素在各自线性范围内具有良好的线性关系，LOQ 为 0. 10 ～ 1. 0 μg /kg，在低、中、高 3 个加 标水平下的平均回收率为 70. 7%～ 94. 9% ，ＲSD 为 4. 0% ～ 9. 4% ，各指标均满足分析检测的要求。该 方法对于牛奶中多类别、多组分抗生素残留的分析监测、快速筛查具有参考意义。