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东汉《金匮要略》记载，黄芪桂枝五物汤由黄 芪、桂枝、白芍、生姜、大枣五味中药组成，是治疗痹 症的名方，具有益气温阳、温经散寒、通痹止痛的功效 。“经典名方标准颗粒研究”属“重大新药创制” 国家科技重大专项课题，该课题拟定了20个经典名 方为研究对象，黄芪桂枝五物汤为其中之一。白芍 作为方中臣药是其重要组成部分。白芍为毛茛科 植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，有养血 调经、敛阴止痛、平抑肝阳之功效，主治血虚萎黄、 月经不调、自汗盗汗、胁痛腹痛等。
1 材料与方法
1. 1 仪器
岛津LC-20A高效液相色谱仪（配有LC-20AT二 元泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20AC自动 进样器），日本岛津公司；ACQUITY UPLC Xevo G2 Q-TOF 液质联用仪，美国 Waters 公司；Sartorius-BS 124S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；分体 式全自动电脑保健陶瓷锅，潮安市天野电器厂；N1001D-WA旋转蒸发仪，日本Eyela公司；LGJ-25C型 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；昆山舒美KQ2200E 型超 声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1. 2 试剂与材料
乙腈、甲醇（均为色谱纯），美国Fisher Scientific 公司；乙酸、磷酸（均为分析纯），国药集团化学试剂 有限公司；水为娃哈哈纯净水；芍药苷（纯度99.30%） 对照品，中国食品药品检定研究院；白芍各批次均由仲景宛西制药股份有限公司提供，批号：140000、 140001，产地浙江；批号：140212、141101、141102、 141103、150823、150826、150901、150903产地为安徽。
1. 3 白芍水煎剂冻干粉的制备
称取9.0 g白芍置于陶瓷锅中，加水1200 ml，浸 泡30 min，称取总质量，设定时间120 min，闭盖武火 煮沸后开盖继续煎煮，至减重750 g后停止煎煮，两 层纱布趁热过滤得滤液。将滤液减压浓缩后冷冻 干燥，得白芍水煎剂冻干粉，保存于干燥器中备用。
1. 4 白芍水煎剂HPLC指纹图谱的建立
1. 4. 1 供试品溶液的制备
精密称取白芍水煎剂 冻干粉0.05 g，以50%甲醇溶解并定容于10 ml容量 瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
1. 4. 2 色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷 酸水溶液（B）；检测波长：230 nm；柱温：30℃；流速： 1.0 ml/min；进样量：20 μl。梯度洗脱程序：0~15 min， 5% A~15% A；15~45 min，15% A~25% A；45~65 min， 25% A~50% A。
1. 5 共有峰定性鉴别
1. 5. 1 供试品溶液的制备
精密称取白芍冻干粉 0.05 g，以 5%甲醇溶解并定容于 10 ml 容量瓶中， 0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
1. 5. 2 色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%乙 酸水溶液（B）；检测波长：230 nm；柱温：室温；流速： 1.0 ml/min；进样量：5 μl。梯度洗脱程序：0~15 min， 5% A~15% A；15~45 min，15% A~25% A；45~65 min， 25% A~50% A。
1. 5. 3 质谱条件
正/负离子模式分别检测；采集 范围m/z 50~1500；ESI离子源参数：毛细管电压：1.7 kV； 锥孔电压：30.0 V；提取锥孔电压：4.0 V；源温： 100℃；脱溶剂气温度：250℃；锥孔气流量：30.0 L/h； 脱溶剂气流量：350.0 L/h；陷阱碰撞能量：6.0 V；传 递碰撞能量：4.0 V。
1. 6 芍药苷含量测定
1. 6. 1 对照品溶液的制备
精密称定芍药苷标准 对照品粉末10.04 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，即得浓度为1004 μg/ml的对照品溶液。
1. 6. 2 样品溶液的制备
精密称取白芍水煎剂冻 干粉0.05 g，置具塞试管中，加5 ml甲醇，称质量，超声 （40 kHz，300 W）提取30 min，放冷补重，摇匀过滤， 续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液。
1. 6. 3 阴性样品溶液的制备
精密量取5 ml甲醇 置具塞试管中，按1. 6. 2项样品溶液的制备方法操 作，即得阴性样品溶液。
1. 6. 4 色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；流动 相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（13∶87）；柱温：30℃；流 速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；洗脱方式：等度洗脱 30 min。
2 结果
2. 1 白芍水煎剂指纹图谱色谱条件的优化
2. 1. 1 检测波长的选择
采用岛津 SPD-M20A 二 极管阵列检测器，对供试品溶液进行扫描，扫描波 长范围 190～400 nm，考察检测波长在 230、254 及 270 nm下的色谱峰分离情况，对比不同波长下HPLC 图谱，在230 nm波长下，白芍HPLC指纹图谱的色谱 峰丰度高且分离度好。故检测波长选用230 nm。
2. 1. 2 流动相的选择
流动相对色谱峰的分离有 着重要影响。首先对有机系流动相甲醇、乙腈进行 考察，在确定了以乙腈为有机相的基础上，继而考 察在水系流动相中加不同体积分数的乙酸或磷酸 对色谱峰的影响，发现在流动相中加乙酸后基线噪 声较大且漂移较严重，而加磷酸可明显消除噪声且 能优化峰形，并改善色谱峰的分离效果，综合考虑 后确定流动相体系为：乙腈-0.05%磷酸水溶液。
2. 1. 3 柱温的选择
色谱柱温度的变化对色谱峰 的分离效果有较强的影响，考察柱温在 25、30 及 35℃时色谱峰的分离情况，随着柱温升高，色谱峰保 留时间提前，分离度下降。综合考虑选取柱温为30℃。
2. 1. 4 流速的选择
流速也是影响色谱峰分离的 关键，考察流速在 0.6、0.8、1.0 及 1.2 ml/min 时色谱 峰的分离情况，流速变快，色谱峰保留时间提前，分 离度下降。综合考虑确定流速为1.0 ml/min。
2. 1. 5 复溶溶剂的选择
选取不同的复溶溶剂进 行复溶会对样品中各化学成分的溶解情况产生一 定影响，也会相应影响指纹图谱中色谱峰的响应值 及丰度。考察100%、50%及5%甲醇分别复溶样品 时的色谱图情况，综合考虑选择使用50%甲醇对样品进行复溶。
2. 2 白芍水煎剂指纹图谱方法学确证
2. 2. 1 精密度
取同一供试品溶液，按1. 4. 2项色 谱条件连续进样6次，考察精密度，确定内标峰后， 测得各共有峰和内标峰之间的相对保留时间和相 对峰面积的 RSD 均＜5.0%，表明本法精密度良好， 仪器性能稳定。
2. 2. 2 稳定性
将供试品溶液按1. 4. 2项色谱条 件，在0、2、4、8、12和24 h分别进样，考察稳定性，测 得各共有峰和内标峰之间的相对保留时间和相对 峰面积的 RSD 均＜5.0%，稳定性良好，可判断供试 品溶液24 h内基本稳定。
2. 2. 3 重复性
按1. 4. 1项制备方法平行制备6份 供试品溶液，依1. 4. 2项色谱条件分别进样，考察重 复性，测得各共有峰和内标峰之间的相对保留时间 和相对峰面积的RSD均＜5.0 %，表明本法重复性良 好。
2. 3 白芍水煎剂HPLC指纹图谱的建立
按1. 4项方法，建立白芍水煎剂HPLC指纹图谱 ，主要色谱峰得到了较好的分离，共标记了12 个共有色谱峰。
2. 4 共有峰定性鉴别
依1. 5项方法，采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术， 得白芍水煎剂正、负离子模式下的总离子流色谱图。依据紫外色谱图和总离子流色谱图色 谱峰保留时间之间的对应关系，及各色谱峰相对应 的质谱参数（准分子离子峰质量数和二级质谱碎片 质量数），初步定性鉴别出白芍水 煎剂 HPLC 指纹图谱中所标记的 12 个共有峰里的 11个。
3 讨论
在前期完成对经典名方黄芪桂枝五物 汤质量表征工作的基础上，继续深入对其组方单味 药白芍进行相关研究。建立了白芍水煎剂化学成 分的HPLC指纹图谱，且通过方法学确证，表明方法 可靠，可作为白芍质量评价的HPLC 指纹图谱研究 方法。利用 HPLC-Q- TOF-MS/MS 技术对白芍的 HPLC指纹图谱中所标记的若干共有峰进行了定性 鉴别，初步明确了其中11个色谱峰的化学成分。并 对10个批次的白芍进行了相似度评价，得到了白芍 因产地、气候、种植条件等不同造成批间相似度较 低，质量差异较大的结论，为今后单味药的选择提 供了一定依据。此外，选取芍药苷作为白芍的指标成分，进行了10个批次白芍冻干粉中指标成分的含 量测定，针对含量测定结果差异较大的问题，做出 以下推测：一是实验所用各批次白芍饮片，均是经 加工后得到，但根据相似度评价及共有峰定性鉴别 结果可知，各批白芍均含有芍药苷亚硫酸酯，而该 成分是药材在加工过程中采用硫磺熏蒸时由芍药 苷转化所得，那么可以推测，各批次使用硫磺加工 熏蒸的过程不统一，本就致使白芍饮片的芍药苷含 量不尽相同，甚至差异较大；二是各批次白芍本身 的产地不同，温湿度等气候条件、采收时间以及具 体生长环境也都各不相同。
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