氨基酸含量测定的研究-昆山舒美KQ500DE使用

珍珠层粉为蚌科动物三角帆蚌 Hyriopsis cumingii （Lea）、褶纹冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠贝科动 物马氏珍珠贝 Pteria martensii（Dunker）的贝壳珍珠层 加工而成的粉末 ，具有镇静安神、解毒生肌、美容养 颜、明目消翳、治疗溃疡、祛除肝火等功效，收载于 《卫生部药品标准·中药成方制剂（第六册）》、四川省中 药材标准（1987年版）以及福建省中药材标准（2006年 版）等标准中。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪（PDA 检测器），昆山舒美KQ500DE 超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），25 mL 氨基酸消解管，氨基酸分析柱 Venusi1- AA （4.6 mm × 250 mm，5 μm，艾杰尔科技），鼓风干燥箱 （天津市泰斯特仪器有限公司），1000 μL 移液枪 （eppendorf），200 μL移液枪（eppendorf），20 μL移液枪 （eppendorf），十万分之一分析天平（Mettler Toledo 公 司），氮吹仪，DK-98-1 型电热恒温水浴锅（天津市泰 斯特仪器有限公司），真空抽滤系统（IKA），抽滤瓶，烧 杯，玻璃棒，容量瓶，蒸发皿，0.22 μm微孔滤膜，一次性 2 mL注射器（江苏宇阳医疗器械有限公司），离心管。

1.2 试药

1.2.1 试剂

氨基酸分析方法包：17 种氨基酸混合标准品（天 门冬氨酸 Asp、谷氨酸 Glu、丝氨酸 Ser、甘氨酸 Gly、组 氨酸 His、精氨酸 Arg、苏氨酸 Thr、丙氨酸 Ala、脯氨酸 Pro、酪氨酸Tyr、缬氨酸Val、蛋氨酸Met、异亮氨酸Ile、 亮氨酸 Leu、苯丙氨酸 Phe、赖氨酸 Lyb 各为 2.5 μmol· mL- 1 ，胱氨酸 Cys 为 1.25 μmol·mL- 1 ）、正亮氨酸标准 品、三乙胺、异硫氰酸苯酯（PITC）等（均由艾杰尔科技 提供）；纯净水，色谱乙腈（赛默飞世尔科技），无水醋酸 钠（北京化工厂）、乙酸（色谱级，赛默飞世尔科技）、浓 盐酸（37.5%，北京化工厂）、正已烷（天津市津科精细 化工研究所）。

1.2.2 溶液配制

（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺 1.4 mL，加乙腈 8.6 mL，混匀。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯 25 μL，加乙腈2 mL混匀。
（3）流动相 A：80%乙腈；水溶液流动相 B：称取 15.2 g无水乙酸钠，加水1850 mL，溶解后用乙酸调pH 至6.5，然后加乙腈140 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤。
（4）正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约 10 mg， 加0.1 mol·L-1 盐酸溶液10 mL使溶解，混匀。

1.2.3 珍珠层粉药材

共收集了 17 批珍珠层粉，来自于浙江、河南、广 东、广西、湖南、安徽等六个省份，17批珍珠层粉的样 品信息，其中S5-6，S13-16号样品通过公司途径 收集，其余样品均收集于当地珍珠养殖场，收集时均为 新鲜或干燥蚌体，依照文献中记载的珍珠层粉制备方 法，经本实验室后期加工得到。三角帆蚌基源的 珍珠层粉均为淡水珍珠层粉，而马氏珍珠贝基源的珍 珠层粉均为海水珍珠层粉。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

采 用 Venusi1- AA 氨 基 酸 分 析 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以 80%乙腈水溶液为流动相 A，以乙 酸钠-乙腈-水溶液作为流动相 B（pH 为 6.5），柱温： 28℃，进样量：10 μL，检测波长：254 nm，流速：0.9 mL· min-1 ，样品温度：5℃，梯度洗脱程序。理论塔板 数按正亮氨酸峰计算应不低于2 × 105 ，所有组分均在 45 min内出峰，17种氨基酸混合标准品，珍珠层粉氨基 酸色谱图。

2.2 粗蛋白的制备

由于珍珠层粉中含有较多的钙盐，如果直接进行 水解，将与盐酸发生反应，生成大量的二氧化碳气体， 致使水解无法进行，故需要先制取粗蛋白。 准确称取珍珠粉约10.0 g于1000 mL烧杯中，加水 10 mL，搅拌调成糊状，缓慢分次加入6 moL·L-1 的稀盐 酸酸化4次，每次10 mL（酸化过程中产生的泡沫不得 有溢出等流失现象），在酸化的过程中，需要充分搅拌， 让稀盐酸和钙盐充分反应，自然放置，待泡基本消退 后，取合适大小的滤纸进行抽滤，并以水洗涤使其充分 转移，抽滤近干时，续加6 moL·L-1 的盐酸适量，浸没固 体物，检查有无气泡产生，轻轻震摇 10 min 使反应充 分，再抽滤，并重复上述浸泡操作，直至无气泡产生，最 后以水洗涤至洗液呈中性，得橙黄色或桔黄色粗蛋白 质。进行干燥和称重，计算粗蛋白产率 。

2.3 供试品衍生溶液的制备

精密称取含量测定项下粗蛋白质 10 mg，置于 25 mL耐高温氨基酸消解管中，准确加入6 moL·L-1 的 盐酸5 mL，加盖密封，置于110℃下，水解24 h，取出，放 冷，开瓶，将水解液过滤并转移至蒸发皿中，水浴蒸干， 残渣以0.1 mol·L-1 稀HCl溶解，移入5 mL容量瓶中，定 容，摇匀，微孔滤膜精滤（0.22 μm），取续滤液 200 μL 至 2 mL 小瓶中，依次准确加入 14％的三乙胺乙腈溶 液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液各 100 μL，并准确加入正 亮氨酸内标溶液 20 μL 加盖，混匀，置于室温下衍生 90 min，加正已烷400 μL，振摇，静置约10 min，取下层 溶液，用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液200 μL， 加入800 μL水稀释，摇匀，于高效液相小瓶中待用。

2.4 氨基酸混合标准品衍生溶液的制备

按 2.3 所述，取混合氨基酸标准溶液 200 μL 至 2 mL小瓶中，自“依次准确加入14％的三乙胺乙腈溶 液”起，至“高效液相小瓶中待用”即得空白溶液。

3 数据分析

利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2012.130723 版本）”软件对 17 批不同基源 和产地的珍珠层粉药材进行相似度评价。17批珍珠层粉药材图谱与对照指纹图谱的相似度范围为 0.881-0.996，说明珍珠层粉药材的质量存在一定差 异。除了S1号样品（浙江诸暨2017年）和S11号样品 （浙江诸暨 2018 年）图谱与对照图谱的相似度小于 0.90以外，其他各批次药材图谱与对照图谱的相似度均大于 0.90，相似度在 0.90 以上的药材占 88.24%，可 见大部分药材质量比较接近，说明药材中氨基酸成分 相似度较高，但可能由于珍珠层粉药材生产过程中受 到气候、水质、环境等因素以及采收加工过程中诸多因 素的影响，表现出一定的差异。

4 结论

本次研究收集了来自6个省份、两种基源（马氏珍珠贝和三角帆蚌）的17批珍珠层粉，首次建立了珍珠 层粉的氨基酸指纹图谱，并较为全面地分析和测定了 珍珠层粉中氨基酸的含量。

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