柴胡疏肝散入血含量的分析-KQ-3200使用

中医药是中国传统文化的宝贵财富和传统医学 的精华，中药治疗具有丰富的临床经验和独特的理论体系，正逐渐受到国际社会越来越多的认识和关 注，所以中医药现代化研究是当前研究的主要热点， 把现代科学技术应用于中医药学领域，是中医药科 学化的必经之路。

1 研究资料

1. 1 实验动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 20 只，购自北 京维通利华实验动物技术有限公司，合 格 证 号: SCXK(京)2014 － 0004，体质量 180 ～ 200 g，饲养于 首都医科大学附属北京友谊医院实验动物中心，常 规条件喂养，温度 22 ℃，湿度 30% ～ 40% ，光照 12 h (8:00—20:00)，噪声 ＜ 60 dB。

1. 2 药品及试剂

柴胡疏肝散，方中各味中药由首 都医科大学附属北京友谊医院中药房提供，经中药 专家鉴定符合《中国药典》2005 版要求 。甲醇和乙 腈(HPLC 级，美国 Fisher 公司)，其他试剂均为分析 纯(国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为经 Milli － Q 净化系统过滤的去离子水。

1. 3 主要仪器

Agilent 1290 UPLC － 6540 accurate mass Q － TOF 色谱 － 质谱联用仪，配置 MassHunter 质谱工作站和 MPP 软件 工 作 站( 美 国 Agilent 公 司);CF16ＲXII 离心机(日本 Hitachi 公司);SAS 涡 旋混合器(英国 Stuart 公司);KQ3200 超声波清洗器 (昆山舒美超声仪器有限公司);Milli － Q 超纯水制备仪 (美国 Millipore 公司);分析天平(瑞士 Mettler)。

1. 4 色谱条件

Water HSS T3 色谱柱(100 mm × 2． 1 mm，1． 8 μm);流动相由 A 相(含 0． 1% 甲酸水 溶液)和 B 相(0． 1% 甲酸乙腈溶液)组成，梯度洗脱 程序:0 ～ 20 min，10% B→90% B;20 ～ 25 min，90% B;25 ～25． 1 min，90% B→10% B;25． 1 ～ 30 min，10% B。流速:0． 20 mL /min;柱温:30 ℃;进样量 5 μL。

1. 5 质谱条件

电喷雾离子源(Dual ESI);雾化器(N2)压力 40 ( psig);辅助气(N2) 流速 10 L /min; Fragment 电 压 175 V; 扫 描 质 量 范 围 M/Z 100 － 1700，扫描速度 1 specra /s，扫描模式为 full － mass 全扫描。正离子扫描毛细管电压为 4． 0 kV，辅助器 温度为 350 ℃ ;负离子扫描毛细管电压为 3． 5 kV，辅 助器温度为 320 ℃。

1. 6 柴胡疏肝散灌胃液制备方法

取处方量陈皮 12 g、柴胡 12 g，川芎 9 g、香附 9 g、枳壳 9 g、芍药 9 g， 炙甘草 3 g，加 10 倍量水浸泡 1 h 后，煎煮 6 h，纱布 过滤，加入 8 倍量水煎煮 4 h，合并 2 次滤液，真空浓 缩干燥，得浸膏(1 g 浸膏相当于原药 1． 125 g)。称 取适量，蒸馏水溶解，即得柴胡疏肝散灌胃药液。

1. 7 血清样品制备方法

含药血清样品制备:取同 批次雄性 SD 大鼠 10 只禁食不禁水 12 h，给予柴胡 疏肝散药液 1． 5 mL /100 g 灌胃，给药 2 h 后，10% 水 合氯醛麻醉大鼠，自大鼠眼眶后静脉丛取血 2 mL 于 含抗凝剂 EP 管中，全血以 4 000 r/min 离心 15 min， 取血清样品，用 4 倍体积冰冷的甲醇提取，12 000 r/ min 离去 10 min，去除蛋白质以及较大的脂质，取上 清液蒸发至干，重新溶于 50 μL 10% 乙腈水溶液中， 即得含药血清。空白血清样品制备:取同批次雄性 SD 大鼠 15 只禁食不禁水 12 h，给予与柴胡疏肝散 药液相同体积的生理盐水灌胃，其余处理方法同含 药血清制备。

1. 8 入血成分分析方法

取含药血清样品、空白血 清样品及柴胡疏肝散水煎剂样品，行 UPLC － QTOF (仪器型号 agilent 1290 － 6540)检测，正负离子模式 各检测 1 遍。采集的数据使用 MassHunter 质谱工 作站和 MPP 软件进行分析，主要包括提取分子特 征、MPP 递归分析、通过离子查找化合物、MPP 软件 差异分析 4 个步骤，建立 UPLC 色谱图。通过对数 据的保留时间、精确质量数进行校准、过滤，找出各 组不同样品之间的差异成分。然后通过本实验室的 中药成分数据库(TCM Database)对正离子模式、负 离子模式化合物进行搜库，找到中药类化合物。对柴胡疏肝散药材含有的化合物 成分进行总结，找出其共有的成分，即为可能入血的 药材成分。

2 结 果

入血成分为柴胡疏肝散水煎剂中及柴胡疏 肝散灌胃大鼠血清中均含有的成分，右上圆圈部分 为柴胡疏肝散药材中采集到的化合物，左上圆圈部分为柴胡疏肝散灌胃大鼠血清中采集到的化合物， 而中下圆圈部分为空白组大鼠血清中采集到的化合 物，左上圆圈和右上圆圈的交集不包含中下圆圈交 集的部分即为可能的入血成分。

3 讨 论

中药复方组成复杂，各种组分物理化学性质各 异，不同的制备方法(如温度、pH 值等)、不同的产 地、不同时期采摘等都会影响中药复方中有效成分 含量，甚至影响疗效。用现代科学技术研究和发展 中药，必须着眼于中药药效物质基础的研究。但传 统方法如色谱、光谱等技术得到的药物成分很可能 只是一般化学成分，或可能只是活性成分的前体物 质，多数中药或复方现行质量标准中测定的所谓 “有效成分”多为主要药物的主要成分或指标性成 分，并无充分依据证明其为有效成分。而UPLC法涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手 段等全新技术，与高效液相色谱法(HPLC)相比，还 增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，具有分析 速度快、分离效率高、检测灵敏度高等优点，可通 过检测分析不同配伍中药加工过程中有效物质成分 的变化及相互影响，较好地探索中药复方配伍规律 及其作用机制。

 

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