化学计量学优选不同制法山楂叶提取物

化学计量学是一门通过数学或统计学方法将对化学体 系的测量值与体系的状态之间建立联系的学科，它的特点 是可以最有效地获取体系有用的特征数据，并通过解析测 量数据最大限度地从中提取有关物质的定性、定量、形态、 结构等信息。化学计量学不仅在数学领域应用广泛，在 中药鉴别、质量控制等研究中也越来越被接受和使用。 本研究运用化学计量学对不同采集地山楂叶药材中采用面 积归一化法所得 15 种成分的峰面积比例进行统计; 应用聚 类分析与主成分分析得到 30 批药材; 利用判别分析建立质 量数学表达式。

1 仪器与材料

1. 1 仪器

安捷伦 1200 型高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦 公司) ; AG-245 型分析天平 ( 瑞士梅特勒-托利多公司) ; LBY-N6K 型全自动血流变仪 ( 北京市普利生仪器有限公 司) ; KQ700 型超声波清洗器 ( 昆山超声仪器有限公司) 。

1. 2 动物

Wistar 雄性 SPF 级大鼠，体质量 200 ～ 220 g， 购于北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许 可证号 SCXK ( 京) 2012-0001。

1. 3 试剂

金丝桃苷 ( 批号 111521-200303) ，购于中国食 品药品检定研究院; 牡荆素鼠李糖苷 ( 批号 151024) 、牡 荆素葡萄糖苷 ( 批号 151103) ，购于上海融禾有限公司， 上述对照品含有量≥98%。乌拉坦 ( 20150401) ，购于天津 光复精细化工研究所; 盐酸肾上腺素 ( 批号 1505301) ，购 于天津市金耀药业有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯，购于 美国 Fisher 公司; 水为娃哈哈纯净水; 其他试剂为分析纯。

1. 4 试药

山楂叶为蔷薇科植物山楂 Crataegus pinnatifida Bge． 的干燥叶，由承德民族师范学院董建新教授鉴定为正 品，具体见表 1。山楂叶制法 A ( 模拟山楂叶成药山玫 胶囊，山楂叶以 50%乙醇为提取液) 、山楂叶制法 B ( 山楂 叶药材加 5 倍量 50%乙醇，加热回流提取 2 次，合并提取 液用 3 倍量水饱和正丁醇溶液提取 3 次，合并的正丁醇提 取液浓缩至干，即得) 、山楂叶制法 C ( 模拟山楂叶成 药益心酮片，以山楂叶提取物 D 为原料制成制剂) 、山楂叶制法 D ( 50%乙醇提取液，通过收集大孔吸附树脂柱不 同体积分数乙醇洗脱液，回收乙醇得清膏) 。


2 方法与结果

2. 1 HPLC 法建立

2. 1. 1 色谱条件

Aglient Zorbax SB-C18 柱 ( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) ; 流动相 0. 1%甲酸水 ( A) -乙腈 ( B) -四 氢呋喃 ( C) ; 梯度 洗 脱 ( 0 ～ 5 min，10% ～ 12% B; 5 ～ 15 min，12%B; 15 ～ 20 min，12%B，前 20 minC 占 0。20 ～ 23 min，12% ～ 14% B; 23 ～ 35 min，14% B; 35 ～ 40 min， 14% ～ 20% B; 40 ～ 50 min，20% ～ 30% B; 50 ～ 60 min， 30% ～ 60%B; 60 ～ 65 min，60% ～ 80% B，20 min 以后 C 占 8%) ; 检 测 波 长 320 nm; 体 积 流 量 1. 0 mL/min; 柱 温 30 ℃ ; 进样量 10 μL。

2. 1. 2 供试品溶液制备

精密称取山楂叶 D ( 2015 年版 《中国药典》方法) 约 0. 05 g，置 50 mL 具塞锥形瓶中，精 密移取 60%甲醇 25 mL，精密称定质量，超声处理 30 min， 待冷却后补足减失质量，上清液以 0. 45 μm 微孔有机滤膜 过滤，即得。

2. 1. 3 对照品溶液制备

精密称取金丝桃苷 15. 5 mg、牡 荆素 葡 萄 糖 苷 22. 0 mg、牡 荆 素 鼠 李 糖 苷 20. 0 mg，置 50 mL棕色量瓶中，甲醇溶剂定容，即得 ( 质量浓度分别 为 0. 31、0. 44、0. 40 mg /mL) ，密封备用。

2. 1. 4 样品测定方法

按 “2. 1. 2”项下方法制备供试品 溶液，在 “2. 1. 1”项条件下进样，色谱图见图 1。

2. 2 方法学考察

2. 2. 1 精密度试验

取 “2. 1. 3”项下混合对照品溶液适 量，在 “2. 1. 1”项条件下连续进样测定 6 次，测得金丝桃 苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷峰面积 ＲSD 分别为 1. 88%、1. 06%、0. 95%，表明仪器精密度良好。

2. 2. 2 稳定性试验

取 “2. 1. 2” 项下供试品溶液 ( 24 号) 适量，在 “2. 1. 1”项条件下于 0、2、4、8、12、24 h 测定，测得金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷 峰面积 ＲSD 分别为 1. 45%、1. 04%、0. 78%，表明供试品 溶液在 24 h 内稳定性良好。

2. 2. 3 重复性试验

取 同 一 批 样 品 ( 24 号) 适 量，按 “2. 1. 2” 项下方法制备供试品溶液，平 行 6 份，在“2. 1. 1”项条件下进样，测得金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、 牡荆 素 鼠 李 糖 苷 峰 面 积 ＲSD 分 别 为 1. 49%、0. 88%、 0. 52%，表明该方法重复性良好。

2. 2. 4 加样回收率试验

取同一批样品 ( 24 号) 适量， 分别加入一定量的金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠 李糖苷，按 “2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液 6 份，在 “2. 1. 1”项条件下进样，测得金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、 牡荆素 鼠 李 糖 苷 加 样 回 收 率 分 别 为 99. 43%、99. 66%、 99. 80%，ＲSD 分 别 为 2. 20%、1. 16%、0. 51%，结 果 与 2015 版 《中国药典》标准符合。

3 讨论

山楂叶质量标准包括 性状鉴定、薄层色谱鉴别以及山楂叶总黄酮和金丝桃苷的 测定。目前的质量标准存在质控指标单一，与药效关联性 不强等问题。本研究在课题组成果-山楂叶指纹图谱基础 上，以中药多组分作用特点，尽可能多的选取色谱峰为研 究目标，同时采用面积归一化法测定了指标成分的比例值， 面积归一化法可体现每种成分所占总成分的含有量百分比， 与中药多组分、多靶点的作用特点相呼应。本实验又利用 化学计量学中聚类分析和主成分分析法，以指标成分比例 值为分析目标，从不同采集地中排除安徽、广东乳源、广 东南昆山、广西桂林、广西贺州、广西梧州、广西玉林及 山东维安，最终剩余多个采集地的山楂叶质量可靠、稳定。 筛选出的山楂叶样品采用判别分析，建立了质量数学表达 式，如有未知质量的山楂叶样品，可把每个色谱峰面积比 例值直接带入数学式中，当 Y 值范围在 13. 15 ～ 16. 08 时， 未知山楂叶质量符合要求，该药材质量评价的方法简便、可靠。