超声波提取法对抑菌活性的筛选

植物源农药的主要成分来源于自然，具有选择性高、低毒、易降解，害物不易产生抗药性等优点，从 植物中寻找抑菌活性物质，是研发新型杀菌剂的热点之一。瑶医药是瑶族人民长期与疾病作斗争的智慧 结晶，104 味经典老班药中，很多是治疗细菌感染的药物，这为新型抑菌活性物质的发现提供了线索。事 实上，虽然国内外对具农药活性植物的筛选一直没有停止，但针对瑶药的农用活性筛选却少见报道。本 研究对我国部分瑶药植物的甲醇提取物进行抑菌活性的筛选，旨在筛选出具有较高活性抑菌植物，为开 发新型植物源农药奠定基础。

烟草青枯菌( Ｒalstonia solanacearum) 和蜡状芽孢杆菌( Bacillus cereus) 由西北农林科技大学无 公害农药研究服务中心提供; 金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 标准菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC25923 购买自广东省微生物菌种保藏中心。供试瑶药购买自广西省南宁市大福子原生草药店，并由 西北农林科技大学生命学院李琰副教授鉴定。31 种瑶药及其科属见表 1。分析纯甲醇和分析纯 DMSO 购自四川西陇化工有限公司; 电子天平，ALC-1100． 2，北京赛多利斯仪器系统有限公司; 旋转薄膜蒸发仪， Ｒ205B 型，上海申生科技有限公司; 超声波清洗器，KQ-250B，昆山市超声仪器生产公司; 循环水式多用真 空泵，SHB-B95A 型，郑州长城科工贸易有限公司。

采用超声波提取法将阴干的植物材料在 40 ℃ 下烘干，粉碎后过 40 目筛，放入自 封袋中。试验前称取 50 g 的植物干粉，加入甲醇进行超声波提取，每次 60 min，重复提取 3 次。过滤后浓 缩，保存于 4 ℃冰箱内待用。

室内生测用于活化细菌性病原菌菌株的液体培养液( LB 培养基) : 称取胰蛋白 胨 10 g、酵母粉 5 g、氯化钠 3 g，加水定容至 1 L，灭菌锅灭菌待用。

采用对供试病菌没有抑菌作用的二甲基亚砜作为溶剂，将供试瑶药提取物溶解。用二甲 基亚砜 － 水溶液将各瑶药提取物按其有效成分含量溶解稀释成 1 000 mg·L － 1 药液 ( 作为母液备用) 。

将供试菌种在试验前 1 d 转接到 LB 培养液中，置于 28℃恒温摇床箱中活化 12 h。

采用二倍稀释法对瑶药提取物进行室内抑菌 活性筛选和最低抑菌浓度( MIC) 测定。测定方法:

( 1) 室内抑菌活性筛选方法: 实验操作在 96 孔板上 进行，每孔加入 50 μL 稀释后细菌数量达 104 cfu·mL － 1 的供试菌菌悬液与 50 μL 质量浓度为 1 000 mg· L － 1 药液，使药液最终浓度为 500 mg·L － 1 ，培养 24 h 后观察结果; 再进一步将母液稀释为 200 mg·L － 1 药 液，实验操作方法同上，使药液最终浓度为 100 mg·L － 1 ，培养 24 h 后观察结果;

( 2) 最低抑菌浓度( MIC) 测定方法: 取编号为 1 ～ 5 的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里灭菌待用。灭菌完成后，除 1 号试管加 入 4 mL 无菌水外，其余试管均加入 2 mL 无菌水。将 1 mL 配制好的质量浓度为 1 000 mg·L － 1 的母液加 入 1 号试管中，混合均匀后，将混合后的药液取 2 mL 加入到 2 号试管中，以此操作至 5 号试管为止。使药 液浓度稀释为 200，100，50 ，25，12． 5 mg·L － 1 共 5 个浓度。在 96 孔板上每孔加入 50 μL 稀释后细菌数量 达 104 cfu·mL － 1 的供试菌菌悬液与 50 μL 药液，使药液最终浓度为 100，50，25，12． 5，6． 25 mg·L － 1 ，以硫 酸链霉素作为对照药剂。培养 24 h 后，通过肉眼比对发现微孔内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生， 则此微孔对应的药液浓度即为此提取物对待测病菌的 MIC 值。

采用二倍稀释法在 500，100 mg·L － 1 的浓度 下，测定了 31 种瑶药植物的甲醇提取物对烟草青枯菌的抑菌活性实验，结果表明: 在 500 mg·L － 1 的浓度 下有 18 种瑶药提取物表现出显著的抑菌活性，在 100 mg·L － 1 的质量浓度下有 3 种瑶药提取物表现出显 著的抑菌活性( 表 1) 。

采用二倍稀释法对穿破石、独脚风、贯众等 3 种瑶药 提取物进行最低抑菌浓度测定。结果表明: 3 种瑶药提取物对烟草青枯菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色 葡萄球菌均有显著的抑制效果。3 种瑶药提取物对烟草青枯菌的 MIC 分别为 25，25，25 μg·mL － 1 ，对蜡 状芽孢杆菌的 MIC 分别为 12． 5，50，50 mg·L － 1 ，对金黄色葡萄球菌的 MIC 分别为 50，25，50 mg·L － 1 。

我国对具农药活性植物的筛选，一般是参考《本草纲目》等古籍和《中国土农药志》《中国有毒植物》 等专著及在生产中人们使用的土农药。前期，国内多位学者对我国陕、甘、青、新、宁、苏、粤、桂、鄂、闽、 川、黔等地区的 2 000 多种野生植物或中草药进行了农用活性的筛选，发现了砂地柏、牛心朴子、掌叶千里 光、辛夷、广陈皮、博落回等多种植物具有较好的杀虫活性; 茄科、百部科、藜科、马钱科、豆科、菊科、仙茅 科、玄参科、芸香科、天南星科、姜科、唇形科、菊科、桔梗科、忍冬科、伞形科、蓼科、大戟科等植物的杀虫活 性值得深入研究; 豆科、禾本科、菊科、伞形科、十字花科、马兜铃科、唇形科、葫芦科、蓼科、木兰科、百合 科、木犀科、莎草科和樟科等植物的杀菌活性具开发应用前景。近 10 余年来，国内学者筛选的范围进一 步扩大，同时更加注重对植物源物质特殊生物活性的发现。



 

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