色谱法同时测定茵栀黄颗粒中的化学成分

茵栀黄颗粒收录于 2015 年版《中华人民共和 国药典》（以下简称《中国药典》）第一部，由茵陈、栀 子、黄芩、金银花 4 味药材的提取物制成 。传统中 药理论认为该方中茵陈为君药，栀子、黄芩为臣药，佐 以具有清热解毒作用的金银花，共同起到清热解毒及 利湿退黄的功效 。

二元高压双泵 LC-20AT 高效液相色谱仪（岛津公司）；SPD-M20A 光电二极管阵列紫外可见光检测 器（岛津公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ES 225SM-DR 型十万分之 一天平（SWISS MADE）；金怡旋涡混合器（金坛市医 疗仪器厂）；SZ-93 自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化仪器设备有限公司）。

化 学 对 照 品 新 绿 原 酸（批 号 AF7050442）、京 尼 平 苷（批 号 AF7110308）、1，3- 二咖啡酰奎宁酸 （批 号 AF8030809）、3，4- 二 咖 啡 酰 奎 宁 酸（批 号 AF7080124）、4，5- 二咖啡酰奎宁酸（批号AF7060542）、 黄芩苷（批号 AF7061702）、滨蒿内酯（批号 AF8030807）、 汉黄芩素（批号 AF7121402）、黄芩素（批号 AF8030808）、 汉 黄 芩 苷（批 号 AB7100922）、千 层 纸 素 A（批 号 AF7110209）均购自成都埃法生物科技有限公司，绿 原 酸（批 号 110753-200413）购 自 中 国 食 品 药 品 检 定研究院，3，5- 二咖啡酰奎宁酸（批号 161022）购 自成都昂赛思生物科技有限公司，木犀草苷（批号 Y05D8H49919）购自上海源叶生物科技有限公司，其 纯度均 >98.0%（HPLC 测定）。市售 1~8 号茵栀黄颗 粒样品，批号分别为 09180011、08118030、08118020、 00918004、00917188、00917122、00917102、 00916101，鲁南厚普制药有限公司。甲酸为分析纯， 天津市富宇精细化工有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯， Fisher 公司；水为超纯水。

色 谱 柱：迪 马 公 司 Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流 动 相：乙 腈（A）-0.1% 甲酸水溶液 （B），梯 度 洗 脱（0~5 min，15%A → 20%A；5~20 min， 20%A → 35%A；20~40 min，35%A → 55%A；40~45 min， 55%A → 35%A）；流速：1.0 mL·min–1 ；检测波长：325 nm；柱温：30 ℃ ；进样量：20 μL；运行时间：45 min。

取茵栀黄颗粒适量，研细，取 0.20 g，精密称定，置 25 mL 具塞锥形瓶中，加 50% 甲醇水 约 20 mL，超声提取（300 W，40 kHz）30 min。提取液 取出放冷后用 50% 甲醇水定容至 25 mL，摇匀，过滤， 弃去初滤液，取续滤液过 0.22 μm 微孔滤膜，即得。 2.2.2 对照品溶液　精密称取新绿原酸、绿原酸、京 尼平苷、1，3- 二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4- 二 咖啡酰奎宁酸、3，5- 二咖啡酰奎宁酸、4，5- 二咖啡 酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素 A 的对照品适量，分别用甲醇溶解， 制成质量浓度均为 1.0 mg·mL-1 的 14 个对照品储备 液。分别取 14 个对照品储备液各 0.1 mL，置同一 5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合对照 品溶液。依次精密吸取新绿原酸、绿原酸、汉黄芩素 的对照品储备液各 1 mL，1，3- 二咖啡酰奎宁酸、木 犀草苷、黄芩素的对照品储备液各 0.5 mL，3，4- 二 咖啡酰奎宁酸、3，5- 二咖啡酰奎宁酸、4，5- 二咖啡 酰奎宁酸的对照品储备液各 1 mL，滨蒿内酯、汉黄芩 苷、千层纸素 A 的对照品储备液各 1 mL，分别置于 4 个 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合 对照品溶液 A、B、C、D。将上述对照品储备液、混合 对照品溶液于 4 ℃保存，备用。

取混合对照品溶液和供试 品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，发现混合对照 品及供试品中各化合物的色谱峰基本达到基线分离， 并且分离度良好，见图 1。

2.3.2 线性关系考察　

精密吸取黄芩苷对照品储备 液 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别用甲醇稀释并 定容至 1.0 mL，即得系列黄芩苷对照品溶液；精密 吸取京尼平苷对照品储备液 0.04、0.06、0.08、0.10、 0.12、0.14 mL，分别用甲醇稀释并定容至 1.0 mL，即 得系列京尼平苷对照品溶液；精密吸取混合对照品 溶液 A 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，混合对照品溶 液 B 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，混合对照品溶液C 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，混 合 对 照 品 溶 液 D 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，分别用甲醇稀释并 定容至 10.0 mL，即得系列混合对照品溶液。在“2.1” 项色谱条件下，取上述各浓度系列对照品溶液分别进 样 20 μL 进行分析，以峰面积积分值 Y 对进样浓度 X （μg·mL-1）进行回归，绘制标准曲线，计算 14 个成分 的回归方程及线性范围。

在流动相的选择上，比较了甲醇 - 水、甲醇 - 0.1% 甲酸水、乙腈 -0.1% 甲酸水溶液，以各色谱峰 分离度、出峰时间、峰形为评价指标。以甲醇 - 水系 为流动相梯度洗脱时，柱压较高，峰形较差；以乙腈 - 0.1% 甲酸水溶液梯度洗脱时，柱压较低，各色谱峰分 离良好且基线平稳，故选定乙腈 -0.1% 甲酸水溶液 作为梯度洗脱流动相。

根据《中国药典》2015 年版及各成分的出峰时 间，比较了供试品溶液在波长 238、280、325 nm 时的 色谱图数据，结果表明在 325 nm 波长下，新绿原酸、 绿原酸、1，3- 二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4- 二 咖啡酰奎宁酸、3，5- 二咖啡酰奎宁酸、4，5- 二咖啡 酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄 芩苷、千层纸素 A 均有较强的吸收，京尼平苷虽吸收 较弱，但是在此波长下仍可以进行有效检测，且该波 长下基线平稳，出峰数较多，色谱峰响应值较高，故最终选择 325 nm 为检测波长。

本实验建立了高效液相色谱法同时测定茵栀黄 颗粒中 14 个有效成分的含量，且该方法操作简单，测 定结果准确可靠，并具有较好的重复性、稳定性，可实 际应用于对茵栀黄颗粒的含量测定，为完善茵栀黄颗 粒质量评价标准提供了实验依据，同时为后续研究茵 栀黄颗粒中有效活性成分提供实验基础。