舒美超声清洗器在抗血栓活性部位筛选中的应用

从活血化瘀类中药中发现抗血栓活性显著的 先导化合物已成为新药研发的一个重要途径，也成 为当下药物研究工作者关注的重点问题。三棱为 黑三棱科植物黑三棱的 干燥块茎，属于破血逐瘀类中药，具有破血行气、消 积止痛等功能，临床常以其炮制品醋三棱入药治疗 血瘀证。近代中西医结合奠基人张锡纯亦极为推 崇三棱，誉之为“化瘀血之要药”，常与莪术配伍，有“三棱长于破血，莪术长于破气”之说。现代研究 发现，三棱能抗血小板活化和聚集，在抑制血栓形 成过程中发挥重要作用。

RＥ－５２ＡＡ旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ＳＨＺ－Ⅲ减压抽滤泵（上海知信实验仪器技术 有限公司）；４２０型恒温水箱（江苏金坛市中大仪器 厂）；ＫＱ－２５０Ｅ 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ＦＡ１１００型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；ＭＥＴＴＬＥＲ ＡＥ２４０型电子 分析天 平 （瑞 士 梅 特 勒 公 司）；ＰＨＳ２－３Ｃ 型 精 密 ｐＨ 计（上海雷磁仪器厂）；ＨＰＧ－２８０ＢＸ 型光照培 养箱（哈尔滨市东联电子技术开发公司）；倒置荧光 显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ５３）；ＢＳ－２００全自动生化分析 仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；ＡＣＳ－６ 型电子秤（山东济南风华电子衡器有限公司） ＤＭＳＯ（上海生工生物工程股份有限公司，批号 ＢＢ０２ＢＡ０００１）；阿司匹林（ＳＩＧＭＡ，批号 ＭＫＣＤ０９５７）， 花生四烯酸（上海梯希爱化成工业发展有限公司，批 号 ３ＡＸＺＩ－ＳＢ）；邻 联 茴 香 胺 （ＳＩＧＭＡ，批 号 ＭＫＣＣ７５０１）；纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。三 棱药材购自安徽亳州隆泰药业有限公司（产地：广西， 批号２０１５０４０１），经山东中医药大学张兆旺教授鉴定 为黑三棱科植物黑三棱的干燥块茎，符合２０１５年版 《中国药典》一部三棱项下规定。 斑马鱼为 ＡＢ 系３ｄｐｆ（Ｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， 受精后的天数）野生型健康斑马鱼，购于国家斑马 鱼养殖中心，养殖于山东省科学院生物研究所。涉 及的动物实验经山东省中医药研究院动物伦理委 员会批准，批准号２０１７００３。

取醋三棱药材１０ｇ，粉碎至粗 粉，用８０％乙醇浸提２次，合并提取液，减压浓缩得 总提取物浸膏２４０．９ｍｇ。将浸膏悬浮于水中依次 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶 剂。得到石油醚萃取物３７．６ｍｇ，乙酸乙酯萃取物 ４３．５ｍｇ，正丁醇萃取物７８．５ｍｇ，以及剩余水溶性部分５４．８ｍｇ。４ ℃冰箱保存备用。

正常的３ｄｐｆＡＢ系斑马鱼，随机数字表法分于２４孔 板中，每孔板中放置１１条，设置６个实验组：即空 白对照组、血栓模型组（用１００μｍｏｌ·Ｌ－１花生四烯 酸处理１ｈ）、阳性对照组（用２２．５μｍｏｌ·Ｌ－１阿司匹 林培养６ｈ后，再加入１００μｍｏｌ·Ｌ－１花生四烯酸共 处理１ｈ）、实验药物组（总提取 物、石 油 醚 萃 取 部 位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水部位， 根据预实验确定浓度提取 物 最 终 浓 度 为 １００，７５， ５０，２５，１０μｇ·ｍＬ－１）培养６ｈ后，再加入１００μｍｏｌ· Ｌ－１花生四烯酸共处理１ｈ。

每组随机数字表法挑选１０尾斑 马鱼，用邻联茴香胺染色液（精密称取邻联茴香胺 ３５．７３ｍｇ、醋 酸 钠 ８５．０５ ｍｇ，置 ５０ ｍＬ 量 瓶 中，加 ３０％过氧化氢溶液２．５ｍＬ，再用５０％乙醇定容，摇 匀）染色，在荧光显微镜下观察染色情况并拍照记录， 照片拍摄放大倍数为５０倍。用 ｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓ５．１软 件定量分析斑马鱼心脏红细胞染色强度（ＳＩ），并计算 预防血栓 药 效（％）＝［ＳＩ（药 物 干 预 组）－ＳＩ（模 型 组）］／ＳＩ（正常组）－ＳＩ（模型组）×１００％。

实验数据以ｘ±ｓ表示，均数 比较采用单因素方差分析（Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ），所 有统计学处理均由ＳＰＳＳ２０．０软件统计完成。Ｐ＜ ０．０５表示差异有显著性。

分 离 取 “２．１．１”项下乙酸乙酯部位用１．５倍的硅胶拌样，依 次用丙酮－甲醇（１５∶１～１∶１）进行梯度洗脱，洗脱液 经硅胶薄层鉴别后，合并组成相似的流分，对 Ｆｒｃ．２ 和 Ｆｒｃ．３再进行反复硅胶、ＯＤＳ柱色谱和半制备色 谱纯化，最终得到化合物１～１１。

三棱抗血栓形成活性部位的筛选 花生四烯 酸诱导构建斑马鱼血栓模型并进行三棱抗血栓活 性部位的筛选，检测结果表明三棱提取物的４个萃 取部位中，乙酸乙酯部位对斑马鱼血栓模型心脏红 细胞染色强度显著增加（Ｐ＜０．０１），具有显著抑制 血栓形成的作用，正丁醇部位次之，石油醚部位作用最弱。

网络药理学是近年来单靶点药物研究的基础 上发展起来的一门新兴学科，不仅集成了系统生物 学、网络生物学与化学生物学等学科，而且还整合 了计算预测与实验验证等研究方法，已逐渐成为现 代医药研究中的前沿交叉学科，其所强调的整体性 与系统性和中医药理论不谋而合，更加适合中医药 的学术特点和实际，能够很好的指导药效物质的寻 找等。本课题组前期基于网络药理学方法，通过 中药整合药理学平台（ＴＣＭ－ＩＰ）分析三棱的抗血栓 形成及抗血小板聚集分子机制，发现中枢神经“下 丘脑－垂体”系统在三棱发挥抗血栓形成和抗血小板 聚集过程中发挥了十分重要的作用。因此，本研 究采用斑马鱼血栓模型作为三棱活性部位筛选的 药理模型，其作为一种整体模式生物，具有保守的 神经系统 构 造，可 以 模 拟 中 枢 神 经 系 统 的 调 控 作 用，相比体外细胞模型，更有利于全面反映中药三 棱药效物质的作用机制。