基于生物信息学途径挖掘防治急性高原病的潜在

急进高原后急性高山病( AMS) 的发病率居高 不下，其中高原心脏疾病是很重要的一部分。文 献报道，高原环境运动者 30% 的死亡与高原心脏病 猝死相关。高原心脏病的发生发展比较复杂， 尤其对急进高原后心脏的影响还不甚清楚。前 期实验中，我们应用低氧实验舱模拟海拔 7000 m 高 原环境，应用超声心动图评估了 SD 大鼠在急进高 原后不同时间点( 3 d、7 d、14 d、28 d) 心脏结构和功 能变化，HE 染色病理切片评估了心肌组织病理变 化。发现急性高原低氧可造成大鼠心肌组织水肿， 心脏收缩和舒张功能严重受损。急进高原第 7 天时 大鼠心脏收缩功能受损最严重。目前国内外对 于 AMS 发生机制尚不十分明确，还没有非常有效的 干预策略。虽然很多研究已证实炎性因子、氧化应 激等在急性高原病发生发展过程中起着重要作用， 但均不足以从基因水平全面阐述急性高原病发生机 制，也不足以筛选新的防治急性高原病的药物。本 研究拟通过低压氧舱模拟高原低氧环境，建立急性 高原病大鼠动物模型。通过对高原低氧暴露 7 d 大 鼠心肌组织进行全转录组测序，筛选与急性高原病 相关的差异表达基因。应用 Connectivity Map 数据 库对差异表达基因进行分析比对，通过生物信息学 方法筛选潜在的防治急性高原病的药物。

选取 6 周龄 SPF 级 SD 大鼠，体质量( 200 ± 20) g，雄性，由昆山超声仪器有限公司提供。许 可 证 号: SCXK ( 京) 2016-0006。所有动物实验均通过伦理委员会审核。 采用随机数字表法将 SD 大鼠分为高原低压低氧实 验组( HH 组) 、常压常氧对照组( con 组) 、药物干预 组( Sb203580 组) 。每组 20 只动物。

应用实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司) 模拟高原低氧条件。实 验舱参数设定: 模拟海拔高度7000 m，升降速度 10 m / s，舱内压力 39． 1 kPa，舱内氧气压力 9． 022 kPa。 实验组和药物干预组大鼠均置于实验舱内。实验舱 运行时间 23 h / d，昼夜比 12 h∶ 12 h。每日上午开 仓 1 h 更换垫料、饲料、饮用水。药物干预组大鼠于 每天开仓时腹腔注射 SB203580 溶液 ( 10 mg / kg) ， 每日注射 1 次，每只大鼠连续注射 7 d。对照组大鼠 置于实验舱外，处理等同于实验组大鼠。

ＲNA 提取 各组大鼠饲养 7 d 后处死，开胸取出心脏。应用 Trizol 试剂提取心 肌组织总 ＲNA。取 100 mg 心肌组织样品，加入 1 mL ＲNAstore 样本保存液。按照 Trizol 试剂说明书， 一步法提取心肌组织总 ＲNA。采用 ＲNeasy Mini Kit 纯化总 ＲNA，应用 NanoDrop2000 分光光度计分别 测量 ＲNA 在波长为 260 nm、280 nm 的吸收值，间接 计算出提取的 ＲNA 浓度。使用 2% 琼脂糖凝胶电 泳检测 ＲNA 纯度和完整性。

mＲNA 高通量测序 质检合格的 ＲNA 进行文库构建。使用 HiSeq2500 进行全 转录组高通量测序( 实验组和对照组各 6 只动物) ， 获得 mＲNA 表达谱。使用 FastQC 对原始序列进行 检测，保留高质量的整洁序列( clean reads) 。使用 Cufflinks 2． 0 对所有转录组结果进行汇总整合，并 使用 Ensemble 转录本数据库对获得的结果进行注 释。使用 Cufflinks 软件筛选差异基因。差异基因的 筛选标准为同时满足以下条件: ①在两个样本中测 序读数之和》10 的基因; ②满足│log2 ( FC) │ ＞ 1 ( 上调 2 倍或下调 2 倍) ; ③同时满足 P ＜ 0． 05 和 FDＲ( false discovery rate) ＜ 0． 05。高通量测序检测 由北京博奥公司完成。

GO 分类和 Pathway 分析 应用 SAM 软件筛选出实验组和对照组比较，相对表达超 过 2 倍的差异基因。应用可视化和整合发现的数据 库( DAVID ) 软件对差异基因功能进行基因本体 ( GO) 分类、生物学通路( Pathway) 分析、功能注释聚 类分析，获得差异基因相关功能的功能富集类。

药物数据库筛选与高原低 氧作用机制拮抗的药物 应用生物信息学工具 ConnectivityMap 数据库，整合差异表达 mＲNA 信息， 推测高原低氧相关心肌损伤中差异表达基因与药物 小分子功 能 的 关 系。将 比 对 系 数 OＲ ＜ 1 且 P ＜ 0． 05的药物定义为具有防治急性高原病的效应。

各组动物完成实验 处死后，剖开胸腔，无菌条件下取出心脏。4 ℃ PBS 溶液漂洗，滤纸吸干。用电子天平称量心脏湿质量 后，置于 80 ℃恒温干燥箱烘干 48 h 至恒质量，称重 心脏干质量。计算组织含水量 = ( 湿重 － 干重) /湿 重 × 100% 。

各组动物完成实验 处死后，剖开胸腔，无菌条件下取出心脏。4 ℃ PBS 溶液漂洗，滤纸吸干。组织用 40 mL /L 多聚甲醛溶 液固定 24 h，常规脱水，石蜡包埋，连续切 5 片，片厚 约 4 μm，HE 染色，中性树胶封片，光镜下观察心肌 组织病理学变化。

AQP1 mＲNA 检测 应用 real time PCＲ 技术检测心肌组织 AQP1 mＲNA 表达。通过 Ｒeverse Transcription Kit 试剂盒将心肌组织 ＲNA 逆 转录为 cDNA，使用荧光定量 PCＲ 试剂盒进行 AQP1 mＲNA 相对表达水平测定。检测总体系为 25 μL ( 其中上下游引物各 0． 5 μL、Premix 12． 5 μL，cDNA 模板 2 μL、ddH2O 9． 5 μL) 。PCＲ 程序参照试剂盒中提供的两步法检测: 95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 个循环。各组实验独立重复 3 次。以 β-actin 作为内参基因，采用 2-ΔΔCt法计算 mＲNA 相对表 达量，引物由上海生工合成。AQP1 上游引物为 5’- GCCAGCGAGTTCAAGAAG-3’，下 游 引 物 5 ’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。β-actin 上游引物为 5 ＇-TTCGCGGGCGACGATGC-3 ＇，下 游 引 物 为 5 ＇- CGAAGTCCAGGGCGAC-3＇。

采用 SPSS 16． 0 统计软件进行 分析。计量资料以 x ± s 表示，进行正态分布和方差 齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析，两组 间差异采用独立样本 t 检验。P ＜ 0． 05 为差异有统 计学意义。

将相对表达量 比值在 2 倍以上，且差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) 的 mＲNA 作为差异表达 mＲNA。与对照组比较，高 原低氧实验组大鼠心肌组织中 1 084 个 mＲNA 表达 发生显著变化。其中 457 个 mＲNA 表达上调，627 个 mＲNA 表达下调 。