复方菝葜颗粒化学模式识别研究（KQ500DE使用）

复方菝葜颗粒（ＣｏｍｐｏｕｎｄＲｈｉｚｏｍｅＳｍｉｌａｃｉｎｕｓＧｒａｎｕｌｅ，ＣＲＳＧ）是“湖南国华制药有限公司”具有独 家知识产权的抗肿瘤制剂，该制剂由菝葜、鱼腥草、猫爪草、款冬花、土鳖虫、枸杞子、大枣七味中药材和鲜 鳢鱼组成，为临床癌症辅助治疗的常用药物。现有研究表明，ＣＲＳＧ 具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和增 强机体免疫等活性，适宜用于改善非小细胞肺癌、子宫颈癌伴有咳嗽、胸痛、带下异常等症状，该药可供多 种癌症的辅助治疗运用。

１ 实验部分

１．１ 仪器、试剂及材料

１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ型高效液相色谱系统（安捷伦科技公司）；ＡＬ２０４电子分析天平（梅特勒－托利多公司）； KQ-500DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；冷冻干燥机（宁波双嘉仪器有限公司）。 绿原酸对照品（纯度≥９９．３９％，批号：ＭＵＳＴ－１７０３０６２０）购自成都曼斯特生物科技有限公司；落新妇 苷对照品（纯度≥９８％，批 号：１ＤＢＧ－ＱＨＴＲ）购自中国食品药品检定研究 院；新 绿 原 酸 对 照 品（纯 度≥ ９８％，批号：ＣＨＢ１７０９１４）、隐绿原 酸 对 照 品（纯 度≥９８％，批 号：ＣＨＢ１７０８２８）、金 丝 桃 苷（纯 度≥９８％，批 号：ＣＨＢ１６０９０４）、异槲皮苷（纯度≥９８％，批号：ＣＨＢ１６０９１２）、３，５－二咖啡酰奎宁酸对照品（纯度≥９８％， 批号：ＣＨＢ１７１０１３）、３，４－二咖啡酰奎宁酸对照品（纯度≥９８％，批号：ＣＨＢ１６０７２５）、４，５－二咖啡酰奎宁 酸对照品（纯度≥９８％，批号：ＣＨＢ１６０７２６）均购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲酸和甲醇均为色谱 纯（美国 ＴＥＤＩＡ 公司），其余试剂均为分析纯，水（华润怡宝饮料（长沙）有限公司）。 经湖南省中医药研究院中药研究所刘浩助理研究员鉴定，菝葜为百合科植物菝葜Ｓｍｉｌａｘｃｈｉｎａ Ｌ． 的干燥根茎；鱼腥草为二白草科植物蕺菜 ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．的新鲜全草或干燥地上部分；猫爪 草为毛莨科植物小毛莨ＲａｎｕｎｃｕｌｕｓｔｅｒｎａｔｕｓＴｈｕｎｂ．的干燥块根；枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Ｌｙｃｉｕｍ－ ｂａｒｂａｒｍ Ｌ．的干燥成熟果实；大枣为鼠李科植物枣Ｚｉｚｉｐｈｕｓｊｕｊｕｂａ Ｍｉｌｌ．的干燥成熟果实；款冬花为菊 科植物款冬 Ｔｕｓｓｉｌａｇｏｆａｒｆａｒａ Ｌ．的干燥花蕾；土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖 Ｅｕｐｏｌｙｐｈａｇａｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｗａｌｋｅｒ 或冀地鳖ＳｔｅｌｅｏｐｈａｇａＰｌａｎｃｙｉ（Ｂｏｌｅｎｙ）的雌虫干燥体。复方菝葜颗粒（湖南国华制药有限公司，批号依 次为Ｓ１：２０１７０９０１、Ｓ２：２０１７０９０２、Ｓ３：２０１７１２０１、Ｓ４：２０１７１２０２、Ｓ５：２０１８０３０１、Ｓ６：２０１８０３０２、Ｓ７：２０１８０３０３、 Ｓ８：２０１８０４０１、Ｓ９：２０１８０４０２、Ｓ１０：２０１８０４０３）。

１．２ 色谱条件

色谱柱：ＥＣ－Ｃ１８柱（５０×３．０ｍｍ，２．７μｍ）；流动相：Ａ 为甲醇，Ｂ为０．３％甲酸水溶液。梯度洗脱程 序：０～２ ｍｉｎ，２％Ａ；２～５ ｍｉｎ，２％ ～７％Ａ；５～１２ｍｉｎ，７％ ～１１％Ａ；１２～１５ｍｉｎ，１１％ ～１４％Ａ；１５～ １７ｍｉｎ，１４％～１６％Ａ；１７～１８ｍｉｎ，１６％～１８％Ａ；１８～２０ｍｉｎ，１８％～２０％Ａ；２０～２１ｍｉｎ，２０％～２４％Ａ； ２１～２４ｍｉｎ，２４％～２６％Ａ；２４～２８ｍｉｎ，２６％～２８％Ａ；２８～２９ｍｉｎ，２８％Ａ；２９～３０ｍｉｎ，２８％～３１％Ａ；３０ ～３５ｍｉｎ，３１％～４８％Ａ；３５～３８ｍｉｎ，４８％Ａ。体积流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：２５℃；进样量：２μＬ；检测波 长：２８０ｎｍ。

１．３ 溶液的制备

１．３．１ 对照品溶液

取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、落新妇苷、３，４－二咖啡酰奎宁 酸、３，５－二咖啡酰奎宁酸，４，５－二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，加适量甲醇制成含绿原酸９０μｇ／ｍＬ、新 绿原酸１０２．７μｇ／ｍＬ、隐绿原酸７２．８μｇ／ｍＬ、金 丝 桃 苷１０１．８μｇ／ｍＬ、落 新 妇 苷１３３μｇ／ｍＬ、异 槲 皮 苷 １０４．８μｇ／ｍＬ、３，４－二咖啡酰奎宁酸２１７．８μｇ／ｍＬ、３，５－二咖啡酰奎宁酸９３．２μｇ／ｍＬ，４，５－二咖啡酰 奎宁酸９５．５μｇ／ｍＬ的对照品溶液。

１．３．２ 供试品溶液

精密称取复方菝葜颗粒１．０ｇ，加甲醇定容至１０ｍＬ，称重后密闭，于２５０ Ｗ、４０ｋＨｚ 超声溶解，放冷后，加甲醇补足失重，摇匀，过滤，取滤液用０．２２μｍ 滤膜过滤，得到复方菝葜颗粒提取物， 备用。

１．３．３ 单味药材供试品溶液

精密称取菝葜、鱼腥草、猫爪草、枸杞子、大枣（去核）各１５ｇ，款冬花、土鳖 虫各５ｇ，第一次加９４０ｍＬ水（煎煮１．５ｈ），第二次加７５２ｍＬ水（煎煮１ｈ），合并煎煮液，浓缩，利用冷冻 干燥仪干燥，得浸膏，备用。

１．４ 方法学考察

１．４．１ 精密度试验

取同一供试品溶液（Ｓ１），连续进样６次，记录色谱指纹图谱，选择出峰稳定、峰面积 较大、响应值最高、分离度良好的８号峰（绿原酸）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 的相对标准偏差（ＲＳＤ）均低于２％，表明仪器精密度良好。

１．４．２ 重复性试验

分别取 ＣＲＳＧ（Ｓ１）６份，按照１．３．２方法制备供试品溶液，按照１．２色谱条件进行检 测，记录指纹图谱，以８号峰（绿原酸）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 ＲＳＤ 均低于 ２％，表明该方法重复性良好。

１．４．３ 稳定性试验

取同一供试品溶液（Ｓ１），分别于０、４、８、１２、１６、２４ｈ进样检测，记录指纹图谱，以８号 峰（绿原酸）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 ＲＳＤ 均低于２％，表明供试品溶液在 ２４ｈ 内稳定性良好。

２ 结果与讨论

按照１．３．２方法制备１０批次样 品的供试品溶液，各取２μＬ 在１．２色 谱 条 件 下 进 行 色 谱 峰采集，得到１０批ＣＲＳＧ 的指纹图谱。确定１８个 色谱峰为１０批 ＣＲＳＧ 所共有。使用“中药色谱指 纹 图 谱 相似度评价系统（２０１２Ａ 版）”软件计算模拟得到对照色谱 图（Ｒ）。以８号峰（绿原酸）为参照色谱峰（Ｓ），计 算１０批 ＣＲＳＧ 各个色谱峰的相对保留时间。 结果显示，不同批次间各共有峰的保留时间ｔＲ和相对峰面 积的 ＲＳＤ大部分均在１％左右，初步判断１０批复方菝葜 颗粒样品成分较稳定，但仍存在一定差异。取１．３．１项下制备的除鲜鳢鱼外的其余７味药材样品，分别精密吸取２μＬ进样并记 录 ＵＰＬＣ色谱图，确认复方菝葜颗粒 ＵＰＬＣ指纹图谱的１８个特征峰的来源。７种单味药材对复方 菝葜颗粒 ＵＰＬＣ指纹图谱均有贡献，其中２、４、５、７、８、１０、１２～１６号峰来自菝葜，２号峰来自鱼腥草，１、３、９ 号峰来自猫爪草，５、７、９、１３、１４、１７、１８号峰来自款冬花，１和６号峰来自枸杞子，１１号峰来自大枣。其中 不同的单味药材有多个共有峰，表明中药材中其成分的复杂性。菝葜和款冬花拥有多个不同的共有峰，表 明了这２味药材对于整个复方的化学成分的重要性。采用相似 度 软 件 计 算 样 品 Ｓ１～Ｓ１０ 的 相 似 度，结 果 依 次 为：０．９７４、０．９７３、０．９７９、０．９８２、０．９９１、 ０．９９１、０．９９４、０．９９２、０．９８８、０．９９１。由此可知，１０批次样品中 Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０相似度良好，均大于 ０．９８５；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４相似度稍低，均大于０．９７０。来自不同批次ＣＲＳＧ 样品的 ＵＰＬＣ色谱图是相似的，各 批次制剂共有成分出峰时间大致相同，成分较稳定。

３ 结论

采 用 ＵＰＬＣ 法 建 立 复 方 菝 葜 颗 粒 指 纹 图谱，对各成分进行药材归属，并对主要特征峰进行 指认，通过相似度评价和 ＨＣＡ、ＰＣＡ、ＯＰＬＳ－ＡＤ 等 化学计量学方法考察批次间稳定性，寻找造成批次间差异的特征性成分，希望为建立全面可靠的复方菝葜 颗粒质量控制标准提供理论依据。



 

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