液相色谱指纹图谱研究（昆山舒美KQ-400KDE使用）

柴胡安心胶囊为河北医科大学第一医院的医院制 剂( 批准文号: 冀药制字 Z20060013) ，由柴胡、葛根、白 芍、桂枝、夏枯草等 14 味药材组方，具有疏肝理气、镇 静安神、调和营卫之功效，主治焦虑抑郁和心脏神经 官能症。有报道采用高效液相色谱( HPLC) 法测定 处方中单味药材代表成分和建立单味药材的指纹图谱，柴胡安心胶囊( CHANCs) 的质量标 准目前只 有显微鉴别和薄层鉴别，尚未见关于其指纹图谱研 究方面的报道。

1 仪器与试药

1．1 仪器

1200 Series 型高效液相色谱仪( 美国 Agilent 科技 有限公司) ; Sartorius BS 110S 型电子分析天平( 北京赛多利斯科学仪器有限公司) ; 昆山舒美KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ; 微孔滤膜 ( 0． 45 μm，上海兴亚净化材料厂) 。

1．2 试药

没食子酸对照品( 批号为 17062510) ，大豆苷对照 品 ( 批 号 为 17060913) ，肉 桂 酸 对 照 品 ( 批 号 为 20171102) ，葛根素对照品( 批号为 17072302) ，绿原酸 对照品( 批号为 17081021) ，规格均为每瓶 20 mg，均购 于上海士锋生物科技有限公司; 芦丁对照品( 批号为 20130809) ，槲皮素对照品( 批号为 20121205) ，规格均 为每瓶 20 mg，均购于美仑生物科技有限公司; 柴胡安心胶囊( 规格 为 每 粒 0． 5 g，批 号 分 别 为 150601，150518， 150419，150407，080115，080302，080403，20180725，编 号分别为 S1 ～ S8，河北医科大学第一医院) 。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱: Diamonsil C18 柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ; 流 动 相 : 0． 5% 乙 酸 水( A) － 甲 醇( B) ，梯 度 洗 脱 ，0 ～ 40 min 时 5% ～ 25% B，40 ～ 60 min 时 25% ～ 60% B， 60 ～ 80 min 时 100% B; 检 测 波 长 : 254，275，290， 330 nm; 流速: 1 mL / min; 进样量: 10 μL; 柱温: 30 ℃。 样品(批号为 S2 )制备供试品溶液并取混合对照品 溶液，按拟订色谱条件分别进样，记录 275 nm 波长下的 色谱图，详见图 1。葛根素峰与相邻峰分离较好，峰面积 较大，理论板数不低于 300 000，故选其作为参照峰。2 h 空白溶液和供试品溶液色谱图表明，检测系统无其他峰 干扰，组分在 80 min 内出峰完全。

 2．2 溶液制备

称取葛根素对照品 30 mg，精密称定，置 10 mL 容 量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别称 取大豆苷、没食子酸、绿原酸、肉桂酸、芦丁、槲皮素对照 品( 17，7，21，12，21，18 mg) ，用甲醇定容于 25 mL 容量 瓶中，作为对照品贮备液。称取同一批样品( 批号为 S2) 内容物 0． 5 g，精密称 定，加入约 50 mL 50% 乙醇回流 1． 5 h，过滤，残渣中加 入 50 mL 50% 乙醇继续回流 1． 5 h，重复 2 次，合并 3 次 滤液，减压浓缩至约 15 mL，加 50% 乙醇定容至 25 mL， 摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2．3 指纹图谱检测波长确定

处方中的柴胡药效成分柴胡皂苷类吸收波长约在 230 nm，白芍的芍药苷最大吸收波长约为 254 nm，葛根 活性成分葛根素的最大吸收波长为 280 nm，夏枯草有 效成分迷迭香酸的最大吸收波长约为 320 nm。为 使该复方制剂中的主要化学成分均能显现最大紫外吸 光度，尽可能地反映组方中代表成分的综合特点，本研 究中利用 DAD 检测器扫描 190 ～ 400 nm 波长信号，依 据具有药效作用的药材化学成分的紫外吸收光谱特征， 最终选取了 4 个特征波长( 254，275，290，330 nm) 。

2．4 方法学考察

精密度试验: 精密吸取供试品溶液[取样品(批号为 S2 )依法制备] 10 μL，连续进样 6 次，分别记录 4 个检测 波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间和峰面积 为参照，四波长各指纹峰相对保留时间的 ＲSD 均小于 1． 00% ，相对峰面积的 ＲSD 均小于 3． 03% ( n = 6 )，表 明仪器精密度良好。 稳定性试验: 精密吸取供试品溶液[取样品(批号为 S2 )依法制备]分别于 0，4，8，12，24 h 时进样测定，记录 4 个检测波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间 和 峰 面 积 为 参 照 ，四 波 长 各 指 纹 峰 相 对 保 留 时 间 的 ＲSD 均 小 于 1． 00% ，相 对 峰 面 积 的 ＲSD 均 小 于 3． 00% ( n = 6 )，表明供试品溶液在 24 h 内基本稳定。 重复性试验: 取样品(批号为 S2 )，平行制备供试品 溶液 6 份，精密吸取 10 μL 进样测定，分别记录 4 个检 测波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间和峰面 积为参照，四波长各指纹峰相对保留时间的 ＲSD 均小 于 1． 00% ，相对峰面积的 ＲSD 均小于 2． 94% ( n = 6 )， 表明方法重复性良好。

2．5 C H A N C s 四波长指纹图谱分析

平行四波长指纹图谱的建立: 将 8 个批次样品的供 试品溶液分别进样测定，记录色谱图。以葛根素峰为参 照物峰，按峰出现率 100． 00% 计，确定各检测波长下的 共有指纹峰，分别是 63 个( 254 nm) 、65 个( 275 nm) 、53 个( 290 nm) 、27 个( 330 nm) 。将 8 批样品指纹图谱信号 导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统 4． 0”软件，按平均值法生成对照指纹图谱( ＲFP) 。

3 讨论

3．1 色谱条件选择

柴胡安心胶囊主要药材的成分如没食子酸、大豆 苷、肉桂酸等极性差异较大，故首选梯度洗脱。试验过程 中，发现色谱图中 4 个主成分大峰难以分开，多次更换 流动相比例和色谱柱均达不到基线分离，最后通过逐一 单位药材按供试品溶液方法处理进样比对已知葛根中 相关成分极性相差较小导致。故参考《中国药典》的方 法，选择 5% ～ 25% 甲醇在 40 min 内缓慢升高梯度，使 其相关峰得到分离。选择流动相时，发现没食子酸和大 豆苷的色谱图拖尾严重，选择了不同体积分数的醋酸溶 液，发现随着醋酸比例的升高，上述成分的峰形逐渐对 称，进而达到测定要求

3．2 平行指纹图谱技术的均值法评价

利用任意的单个波长均不能完整地表达制剂中不 同种类化学成分的全部指纹信息，因此选择单味药材中 具有药效作用的主要成分下的特征波长，对不同波长下 色谱图进一步整合，得到复方制剂的多维信息，才能最 终鉴别其真实质量。本试验中分别采用独立权重法、均 值法和投影参数法、信息熵权重法整合各批次样 品在 4 个特征波长下的定性、定量指纹图谱信息，以系 统指纹定量法评价质量，发现 8 个批次的样品质量等级 基本一致。结合均值法简单便捷的特点，最终选择其作 为整合指纹整体信息的方法。

 

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