不同途径给药的大鼠体内药动学研究-KQ-200VDE使用

包虫病是棘球绦虫的幼虫于人体内所致的一种严重的人兽共患寄生虫病，有“寄生虫肿瘤”之称， 新疆为高发区。现阶段以外科手术治疗为首选， 但术中易播散，复发率较高。药物治疗因能降低复 发率、提高手术治愈率而不断得到肯定。

材料与方法

1 药品与试剂

DH-004( 新疆华世丹药业股份有限公司，批号: 171213，纯度≥95% ) ; 替硝唑对照品( 中国食品药 品检定研究院，批号: 100336-201704，纯度 ＞ 98% ) ; 无水甲 酸 ( 天津市光复精细化工研究所，批 号: 20110527，色谱纯) ; 乙醚( 天津市富宇精细化工有 限公司，批号: 20130516，分析纯) ; 甲醇( 美国 Sigma 公司，批号: 155809，色谱纯) ; 乙腈( 美国 Fisher 公 司，批号: 150941，色谱纯) ; 水为超纯水。

2 仪器

Acquity H-Class UPLC( 美国 Waters 公司) ; QDA 单重四级杆质谱检测器 ( 美 国 Waters 公 司) ; NM32LA 氮气发生器( 英国 Peak 公司) ; FJY 1002 UVF 基因研究型超纯水机( 青岛富勒姆科技有限公 司) ; BP211D 电子天平( 德国 Sartorius 公司) ; KQ 200VDE 双频数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ; IKA MS3 数显型涡旋振荡器( 德国 Ika 公司) ; HC 2518 高速冷冻离心机( 安徽中科中佳科学仪器有限公司) ; BYN100 1 氮吹仪( 上海秉越 电子仪器有限公司) 。

3 动物

健康 Wistar 大鼠，12 只，雌雄各半，体重( 200 ± 20) g，新疆医科大学实验动物中心，合 格 证 号: SYXK( 新) 2016-0004。

4 对照品溶液配制

精密称取 DH-004 10． 20 mg( 实际称量) ，置于 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇使药物溶解并定容制 成 1． 02 mg·mL － 1的储备液; 精密吸取适量，用甲醇 稀释成 0． 051，0． 102，0． 51，1． 02，2． 55 和 5． 1 μg· mL － 1的系列标准溶液，置于 4 ℃ 冰箱冷藏备用。精 密称取替硝唑 10． 20 mg，置于 10 mL 棕色量瓶中， 加甲醇使药物溶解并定容制成 1. 02 mg·mL － 1的储 备液; 用甲醇稀释，配制成 8. 16 μg·mL － 1 的内 标 溶液。

5 色谱/质谱条件

色谱柱: Acquity Uplc BEH C18色谱柱( 50 mm × 2． 1 mm，1． 7 μm) ; 流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0. 1% 甲酸，梯度洗脱: 0 ～ 0． 5 min，9% ～ 11% A; 0. 5 ～ 2． 51 min，11%A; 2． 51 ～ 4． 0 min，11% ～ 15． 5% A; 4. 0 ～ 5． 0 min，15． 5% ～ 90% A; 5． 0 ～ 5． 1 min，90% ～ 50% A; 5． 1 ～ 6． 0 min，50% A; 6． 0 ～ 8． 0 min，50% ～ 9% A; 8． 0 ～ 10． 0 min，9% A; 柱温: 30 ℃ ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ; 进样量: 5 μL。离子源: ESI; 离子检测方 式: MＲM; 离子极性: 正离子; 锥孔电压: 15 V; 毛细 管电压: 0． 8 KV; 离子源温度: 124 ℃ ; DH-004 m / z 331． 1，替硝唑 m / z 81． 0。

6 实验动物分组

Wistar 大鼠 12 只，雌雄各半，随机分为 2 组: 灌胃( ig) 给药组、静脉注射( iv) 给药组，每组 6 只。 ig 给药组给予 0． 5% 羧甲基纤维素钠水溶液配置 的 DH-004 混悬 液( 50 mg·kg － 1 ) ; iv 给药 组 给 予 2% 乙醇和生理盐水配制的 DH-004 混 悬 液( 10 mg·kg － 1 ) 。

7 给药及血样采集

将大鼠禁食不禁水 12 h，按照相应剂量分别 ig 及尾 iv 给药。ig 给药组于给药前及给药后 0. 25， 0. 5，0． 75，1，2，4，6，8，12 和 24 h 眼底静脉丛采血 ( 0． 3 ～ 0． 4) mL; iv 给药组于给药前及给药后 0. 17，0． 33，0． 5，0． 75，1，2，4，6，8 和 12 h 眼底静脉丛采血 ( 0． 3 ～ 0． 4 ) mL，置肝素钠抗凝离心管中，3 500 r·min － 1离心 15 min，血浆置 － 20 ℃冰箱保存。

8 血浆样品处理

取 1． 5 mL 离心管，加入内标溶液20 μL，氮气吹 干，加入血浆样品 100 μL，超声 5 min，涡旋 30 s，加 入 200 μL 乙腈，涡旋震荡 3 min，12 000 r·min － 1离心 10 min，上清液进样检测。 9 数据处理 将样品峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线 方程，求得不同时间点的血药浓度。以平均血药浓 度-时间作图，得到 DH-004 的血药浓度-时间利用 Kinetica 5． 0 药动学软件进行非房室模型分析， 得到主要药动学参数，比较 DH-004 不同给药途径 在大鼠体内药动学行为差异。

结 果

1 专属性

取空白血浆、空白血浆加标准溶液、大鼠血浆样 品，均按“8”项下方法处理，色谱图见图 1，DH-004 和内标的保留时间分别为 1． 7 和 5． 1 min，峰形良 好，大鼠血浆中内源性物质不干扰 DH-004 和内标 的测定，方法专属性良好。

2 标准曲线

精密吸取 DH-004 系列标准溶液和内标溶液各 20 μL，氮气吹干，加入大鼠空白血浆 100 μL，按照 “8”项 下 方 法 操 作，配 制 相 当 于 DH-004 浓 度 为 10. 2，51，102，255，510 和 1 020 ng·mL － 1 的血浆样 品，进样分析。以 DH-004 浓度为横坐标，DH-004 峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，进行线性回归， 得到 DH-004 的标准曲线方程为: Y = 0. 003 3X － 0. 003 7( r = 0. 999 8) 。结果表明，DH-004 在 10. 2 ～ 1 020 ng·mL － 1 浓度范围内线性关系良好。定量下限为 10. 2 ng·mL － 1。

3 精密度

精密吸取 DH-004 对照品储备液，用甲醇稀释 成质量浓度分别为 0. 102，1. 02 和 4. 08 μg·mL － 1的 质控标准溶液。按照“2”项下方法配制成低、中、高 ( 浓度 20． 4，204 和 816 ng·mL － 1 ) 的质控样品，每个 浓度 5 份，按“8”项下方法处理后测定。同法制备 3 批，计算第 1 批批内精密度和 3 批之间的批间精密 度。结果表明，DH-004 质控低、中、高浓度批内、批间 ＲSD 均 ＜ 15%，符合生物样品检测要求。

讨 论

非房室模型法不依赖于任何房室模型假设，能 够较客观地描述药物的体内暴露和动力学行为，广 泛应用于新药的药动学与生物等效性评价。本 实验应用 Kinetica 5． 0 药动学软件对 DH-004 大鼠 血浆药物浓度和时间进行拟合。结果发现 DH-004 药时曲线呈双峰现象，房室模型模拟较复杂。因此， 选用非房室模型作为本实验拟和方法。