测定罗汉松种子-KQ-500DB的使用！

汉松实为罗汉松科植物罗汉松 Podocarpus macrophyllus( Thunb． ) D． Don 和短叶罗汉松 Podocarpus macrophyllus( Thunb． ) D． Don var． maki Endl． 的 种 子 和 花托 。罗汉松实具有治心胃痛、血虚面色萎黄、大补元 气的功效 ，主要含降二萜内酯类及萜类化合物、生 物碱类化合物、黄酮类化合物及多糖类、氨基酸、矿 物元素和维生素等; 其提取物具有调节血脂、抗氧化、 保肝和抗肿瘤等药理作用1。本课题组的前期研究 发现，产于北海的罗汉松种子挥发油中含有大量的川芎 嗪，其在挥发油中的相对百分含量高达 97． 27%。本 研究中建立了罗汉松种子挥发油中川芎嗪的含量测定 方法，为建立罗汉松实药材质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent1260 型 高 效 液 相 色 谱 仪( 美 国 Agilent 公 司) ; 电子天平，XS － 205DU 型天平( 瑞士梅特勒 － 托利 多仪器有限公司，十万分之一) ; KQ － 500DB 数控超声 波清洗器( 昆山舒美超声仪器有限公司) ; CD － UPH － Ⅱ－ 20T 型超纯水器( 成都超纯科技有限公司) ; 万能粉碎机 ( 无锡久平仪器有限公司) 。

1．2 试药

罗汉松种子鲜品采自广西北海，经广西医科大学药 学院生药学教研室李琼讲师鉴定为罗汉松科植物短叶 罗汉松 P． macrophyllus( Thunb． ) D． Don var． maki Endl． 的种子; 川芎嗪对照品( 上海雅吉生物科技有限公司，批号 为 16072405) ; 甲醇为色谱纯，磷酸、石油醚( 30 ～ 60 ℃ ) 和无水硫酸钠均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2．1 溶液制备

取川芎嗪对照品约 20 mg，精密称定，加甲醇溶解 并定容于 25 mL 容量瓶中，得质量浓度为 0． 757 2 g /L 的 对照品贮备液，精密移取 2． 0 mL，置 25 mL 容量瓶中， 用甲醇定容，摇匀，得质量浓度为 0． 060 58 g / L 的川芎 嗪对照品溶液。取自然风干的罗汉松种子，粉碎，过 20 目 筛，称取 100 g 置圆底烧瓶中，加入 1 000 mL 蒸馏水浸泡 12 h 后，保持微沸蒸馏 6 h。馏出液用石油醚萃取 3 次， 每次 50 mL，合并醚层，加入无水硫酸钠脱水，50 ℃ 减 压 回 收 溶 剂 ，得 有 芳 香 气 味 的 淡 黄 色 液 体 ，即 为 挥 发 油 ; 取 挥 发 油 约 100 mg，精 密 称 定，加甲醇超声溶 解 并 定 容 至 10 mL 容 量 瓶 中 ，用 0． 45 μm 微 孔 滤 膜滤过 ，取续 滤液 ，即得 供试 品溶 液。以 甲醇 为阴 性对 表 1 川芎嗪加样回收试验结果( n = 6) 照溶液。

2．2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱: GL Inertsil ODS － 3 C18 柱( 250 mm × 4． 6 mm， 5． 0 μm) ; 流动相: 甲醇 － 0． 1% 磷酸溶液( 60 ∶ 40，V / V) ， 等度洗脱; 流速: 0． 8 mL / min; 检测波长: 298 nm; 柱温: 室温; 进样量: 20 μL。分别精密吸取 2． 1 项下 3 种溶液 进样测定。在此色谱条件下，理论板数以川芎嗪峰计大 于 20 000，分离度大于 1． 5。色谱图见图 1。

2．3 方法学考察

线 性 关 系 考 察 : 精 密 吸 取 对 照 品 贮 备 液 0． 005， 0． 010，0． 020，0． 040，0． 050，0． 100，0． 200，0． 300 mL，分 别置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释，摇匀，定容，即得系 列对照品溶液。按 2． 2 项下色谱条件进样测定，记录峰 面积。以川芎嗪进样质量浓度 ( X)为横坐标、相对应的 峰面积 ( Y) 为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y = 82． 182 X + 11． 538，r = 0． 999 8 ( n = 8 )。结果表明，川芎 嗪进样质量浓度在 0． 38 ～ 22． 72 μg / mL 范围内与峰面 积线性关系良好。 精密度试验: 取 2． 1 项下对照品溶液，按 2． 2 项下 色谱条件连续进样 6 次，测定川芎嗪的峰面积。结果的 ＲSD 为 0． 32% ( n = 6 )，表明仪器精密度良好。 重复性试验: 取挥发油样品 6 份，每份约 100 mg， 精密称定，依法制备供试品溶液，并按 2． 2 项下色谱条 件 进 样 测 定。结果川芎嗪平均含量为 117． 17 μg / g， ＲSD 为 1． 60% ( n = 6 )，表明方法重复性良好。 稳定性试验: 取 2． 1 项下供试品溶液，室温放置 0， 2，4，8，12，24 h 时，按 2． 2 项下色谱条件测定。结果的 ＲSD 为 0． 50% ( n = 6 )，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。 加样回收试验: 取已知含量的挥发油 6 份，精密称 定，分别置容量瓶中，各精密加入一定质量的川芎嗪对 照品，按 2． 1 项下方法制备供试品溶液，按 2． 2 项下色 谱条件进样测定含量，计算回收率。结果见表 1。


3 讨论

采用水蒸气蒸馏法对罗汉松种子进行提 取，得淡黄色的挥发油，提取率为 0． 18% 。在提取挥发 油的过程中发现，将种子浸泡一段时间再蒸馏，可提高 挥发油的提取率。考察了沸程为 30 ～ 60 ℃和 60 ～ 90 ℃ 石油醚对萃取效果的影响，结果 2 种石油醚的萃取效果 相当。此外，萃取剂用量为被萃取液体积的 1 / 2，萃取次 数 3 次时，可获得最佳萃取效果。 经紫外扫描发现，川芎嗪在 298 nm 波长处有较强 吸收，故选择 298 nm 作为测定波长。在加样回收试验 中，对照品的加入量对测定结果的准确性有影响。选择 川芎嗪含量较高的挥发油样品，加入较大量的对照品， 可获得理想的测定结果。经测定，产于北海的罗汉松种 子挥发油中川芎嗪含量为 117． 56 μg / g，种子中川芎嗪 的含量为 0． 212 μg / g。