超声仪对动物性食物分析的应用

维生素 K( vitamin K) 是一类以 2-甲基-1，4- 萘醌为基本结构的化学物，自然界中主要形式有 维生素 K1( vitamin K1 ) 和维生素 K2( vitamin K2 ) 。 维生素 K1 是来自植物性食物的叶绿鲲; 维生素 K2 则是主要来自于微生物发酵产生的甲萘醌。 维生素 K2 由于侧链上异戊二烯基团数量不同而 可分 为 不 同 的 亚 型 并 采 用 n 烯 甲 萘 醌 ( menaquinone-n，MK-n) 进行表示，其中比较常见 的有四烯甲萘醌( menaquinone-4，MK-4) 、七烯甲 萘醌( menaquinone-7，MK-7) 等。维生素 K 除了 作为凝血必需的辅酶因子外，近年来越来越多的 研究显示它在细胞信号转导、骨骼代谢等方面都 发挥着重要作用。 不同生物体的不同部位维生素 K 所呈现的 形式及含量水平是有所差别的。动物体内一方面 可将膳食摄入的维生素 K1 转化为维生素 K2 并得 以储存，一方面可通过共生菌合成一定的维生素 K2，而不同的菌群可能产生不同形式的 MK-n。 目前有关维生素 K 的研究主要集中在植物性维 生素 K1 和来自纳豆芽孢杆菌的 MK-7，而有关 动物体内维生素 K 分布的研究则较为少见，因此 有必要建立适宜的分析技术，可同时在线分析天 然食品维生素 K 的分型、含量水平、分布特征，以 为进一步探讨不同形态维生素 K 的生理功能及 生物活性提供可能。本研究在现有维生素 K1 检 测技术之上，重点针对基质复杂、含量水平相 对较低的样品探讨适宜的样品提取技术和色谱分 离技术，以保证检测方法的灵敏性和准确性。

新鲜畜禽肉及其内脏、鸡 蛋、海 鲜 样 品 于 2018 年 6—8 月购自北京某大型超市，每种样品 不少于 3 kg。样品进行必要的清洗并去除不可食 部分和杂物( 如血块) ，均质处理并混匀缩分，分 装于样品瓶中，－20 ℃ 冷冻保存直至分析。另购 纳豆冻干粉碎混匀后作为高含量 MK-7 样品。

维生素 K1、MK-4 购自 Sigma 公司，MK-7 来 自广东双骏生物科技有限公司，纯度均≥99%。 取标准参考物用甲醇 ∶四氢呋喃( 9 ∶ 1，V /V) 溶解 并制成混合标准储备液，密封后－20 ℃ 冰箱保存; 使用前进一步稀释为系列标准应用液，浓度分别 为 0. 01、0. 02、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40 μg /mL，过0. 22 μm 滤膜后备用。

皱褶假丝酵母脂肪酶( ≥700 U /g) 和木瓜蛋 白酶( 1. 5 ～ 10 U /g) ，购自于 Sigma 公司，胰腺 α淀粉酶( 3000 U /g) 购自 Megazyme 公司。另外准 备色谱纯无水乙醇、甲醇、异辛烷，和分析纯四氢 呋喃、盐酸、石油醚、乙醚等常用试剂。

2695 液相色谱仪配荧光检测器、Empower 色 谱工作站( 均购自 Waters 公司) ，SY-2230 恒温振 荡水浴器( 购自赛伯乐仪器有限公司) ，KQ5200型超声仪( 购自昆山舒美公司) ，Heal Force Neofuge 18Ｒ 台式高速冷冻离心机( 购自力康生物 医疗科技控股有限公司) ，Heidolph Multi Ｒeax 涡 旋振荡器( 购自 Heidolph 公司) ，ＲV10 V-C 旋转 蒸发仪、ＲC2 冷却水循环装置 ( 均 购 自 IKA 公 司) ，METTLEＲ XS205DU ( 感 量 0. 01 mg，购 自 Mettler-Toledo 公司) 和 204 系列电子分析天平 ( 感量 0. 1 mg，购自 Mettler-Toledo 公司) 。

参照《国家食品安全标准 食品中维生素K1的测 定》( GB 5009. 158—2016) 和文献方法，建立高 效液相色谱( high performance liquid chromatography， HPLC) 柱后衍生荧光法测定不同形式维生素 K，以 鸡胗、鸡蛋和纳豆为试样探讨确定最佳提取条件和 最佳测定条件，并进行方法验证。

取 3 g 均质试样，分别采用以下方 法进行样品前处理:

( 1) 酸水解: 试样加入 10 mL 水、7. 5 mL 盐酸溶液( 12 mol /L) ，于 121 ℃高压水 解 10 min，取出冷却后用乙醚、石油醚萃取。

( 2) 酶解: 试样加入 5 mL 40 ℃ 温水、5 mL 磷酸盐缓 冲液( 0. 8 mol /L pH 8) 、0. 2 g 脂肪酶和/或蛋白 酶、淀粉酶，37 ℃ 振荡水浴 2 h，取出后用异辛烷 萃取。试样萃取液于 26 ℃旋转蒸发至近干，氮气 吹干，用 甲 醇 ∶ 四 氢 呋 喃 ( 9 ∶ 1，V /V) 定 容，过 0. 22 μm滤膜后待测。

将维生素 K 混合标准应用液 和试样待测液注入连接了柱后锌柱的 HPLC 色谱 仪，在 柱 温 30 ℃，进 样 量 为 20 μL，流 动 相 为 900 mL甲醇 ∶100 mL 四氢呋喃( 包含 5 mmol 冰乙 酸、11 mmol 氯化锌、6 mmol 无水乙酸钠) ，流速为 1 mL /min 的条件下，进行维生素 K 色谱分离，根 据出峰时间、分离效果、基线水平比较 3 种色谱柱 的分 离 效 果: Atlantis T3 色 谱 柱 ( 4. 6 mm ×250 mm，5 μm ) 、Waters COＲTES-C18 色 谱 柱 ( 4. 6 mm× 150 mm，2. 7 μm) 配 COＲTES-C18 保护 柱( 3. 9 mm×5 mm，2. 7 μm) 和 Waters SymmetryC18( 3. 9 mm×150 mm，5 μm) 。

根据发射波长 200 ～ 600 nm 和激发波长 200 ～ 400 nm 波段内维生素 K 混合标 准应用液最强吸收峰确定荧光检测条件。

按照方法学要求，建立标准曲线及线性范围; 根据仪器信噪比为 3 和 10 时的被测化合物浓度 推算检出限、定量限; 根据 6 次平行测定确定方法 精密度; 按照样品本底浓度的 50%、100%、200% 进行三水平加标回收实验确定方法准确度，若本 底浓度为 0，则按照标准曲线的低、中、高三点的 浓度( 50、100 和 200 ng /mL) 进行 3 水平加标回收 实验确定方法准确度。

按照已建立方法，对肉、蛋、水产品等样品进 行维生素 K 定量分析，所有样品为 2 次平行测 定，结果以均值表示。

采用 Excel 2013 对数据进行编辑，结果以 x 珋±s 表示。采用 SAS 9. 4 软件进行统计分析，提取效 果的比较采用方差分析，以 P＜ 0. 05 为差异有统 计学意义。

经过荧光光谱扫描，证明维生素 K1、MK-4、 MK-7 在发射波长 410. 3 nm 有最大吸收峰，而激 发波长 230 nm 和 320 nm 时有 2 个吸收峰，以 320 nm 处最高 。以此为检测波长，比较 3 种色谱柱对维生素 K 混合标准应用液的分离效果，发 现 Atlantis T3 色谱柱可在 25 min 内有效实现不同 形式维生素 K 的色谱分离 ，出峰时间分 别为 8 min( MK-4) 、11 min ( 维生素 K1 ) 、22 min ( MK-7) ; 而采用 COＲTES-C18和 Symmetry-C18色谱 柱虽然出峰时间快，但是 MK-4 与杂峰之间基线 分离不清会导致定量结果不准，因 此选择 Atlantis T3 色谱柱进行测定。

目前有关食物中维生素 K1 的测定技术比较 成熟。由于维生素 K1 主要来自于植物的绿叶，含量非常丰富，加上其极性较弱，很容易通过反相色 谱进行分离， 并采用紫外检测器进行测定。对于 基质较为复杂且含量较低的婴幼儿配方食品，则 可利 用 维 生 素 K1 能 被 锌 粉 还 原 产 生 氢 鲲 ( K1H2 ) ，而氢鲲可通过荧光仪进行测量，无论是 AOAC 方法还是国标方法 都依据了这一原 理。随着对维生素 K2 生理功能方面的研究日益 增多，特别是 GB 14880—2012已经许可将来自 纳豆的维生素 K2( MK-7) 作为食品营养强化剂使 用，开展不同形式维生素 K 测定的技术研究势在 必行。考虑到维生素 K1 与维生素 K2 都是萘醌衍 生物以及荧光检测器具有更高的灵敏度和特异 度，于是尝试建立高效液相色谱-荧光检测法同时 在线分析不同形式维生素 K。