通过超声清洗仪器对多指标成分含量测定及 HPL

云南重楼（又名滇重楼）Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mazz. 为百合科 （Liliaceae）多年生草本植物，以其干燥根茎入药，被 历版《中国药典》收录，甾体皂苷类成分是其主要活 性成分，具有消肿止痛、清热解毒、凉肝定惊等功 效，在云南省药用植物资源中占据产业化利用主导 地位，是最具代表性和全局影响力的植物资源之一。 目前，滇重楼药材的来源主要以采挖野生资源为主， 由于每年的消耗量远远超出野生资源的年再生能力， 加之滇重楼根茎生长极其缓慢，资源再生周期长（需 要 8～12 年），野生资源利用已经演变成为严重的资 源危机，滇重楼资源的可持续利用问题已经引起政 府、科研院所和相关制药企业的高度关注和重视。 笔者前期在滇重楼样品采集及研究中发现，在滇 西大理、丽江等滇重楼主要原料来源地，根据根状茎 分枝情况不同滇重楼存在 2 种不同形态，一种是根状 茎不分枝，另一种是《云南植物志》和《中国植物志》 没有记载，根状茎常分枝，少则根状茎分为几枝， 多则根状茎分为几十、上百枝，产地俗称多茎重楼、 多芽重楼。多茎重楼与滇重楼相比，多茎重楼因为根 状茎分枝多，叶片数多，叶面积大，光合作用能力强， 生长速度快，产量高，深受种植户的欢迎，已经成为 滇重楼野生变家种及人工种植的重要品种。目前国内 外有关重楼药材的品质评价主要集中在滇重楼和七 叶一枝花 Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara，有关多茎重楼品质评价的研究报道较少，多茎重楼与滇重楼在根状茎分枝上差异较大， 那么，二者在主要活性成分上是否存在差异？为此， 本实验拟采用 HPLC 法测定不同产地多茎重楼根茎 中重楼皂苷 VII、H、VI、II、III、I、V 的含量测定， 建立其 HPLC 指纹图谱，并与滇重楼对照药材根茎 HPLC 指纹图谱进行比较分析，探讨不同产地多茎重楼与滇重楼品质及 HPLC 指纹图谱差异，为多茎重楼 与滇重楼等同入药提供依据。

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公 司）：包括 G1311CVL（四元泵）、G1313A（标准型自动进样器）、G1330B（自动进样器恒温模块）、 G1316A，G1316C（柱温箱）、G1314BC/E/F DAD 检 测器，ChemStation 色谱工作站（美国 AgIlent 公司）；超声波清洗仪（昆山超声仪器）；FY131 型中药粉碎机（天津市泰斯特仪器公司）；电子天平（德国赛多利斯）。

重楼皂苷 VII、VI、II、I 对照品购自中国食品 药品检定研究院，批号分别为 111593-200402、 111592-200301、111591-200301、111590-200402， 质量分数均≥98%；重楼皂苷 H、III、V 对照购自 上海金德生物科技有限公司，批号分别为 20170109、20180606、20170217，质量分数均≥98%。 高效液相流动相乙腈为色谱纯（美国 Tedia 公司）， 水为娃哈哈纯净水，提取样品用乙醇为分析纯。 2017 年 9 月种子成熟期，在多茎重楼和滇重楼 主要来源地采集样品，多茎重楼样品采集根状茎分 枝数为 8～10 枝的植株（生长年限相近），滇重楼样 品采集根状茎节数为 8～9 个（生长年限相近）。样 品经大理大学李海峰教授鉴定为百合科（Liliaceae） 重楼属 Paris L. 滇重楼 Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mazz.。分别到不同产地 采集多茎重楼 10 批（S1～S10）和滇重楼 11 批（A1～ A11），样品去泥洗净后于 40 ℃烘箱中恒温干燥至 恒定质量备用，并将 11 批滇重楼作为对照药材。多 茎重楼及滇重楼样品信息见下表。

理 60 min，滤过，加 75%乙醇定容至刻度，得供试 品溶液。 2.1.4 专属性考察 在“2.1.1”项色谱条件下， 分别取对照品溶液和供试品溶液进样测定，得到 特征峰，供试品溶液与杂质分离良好，无干扰。2.1.5 线性关系考察 将对照品母液在“2.1.1”项 色谱条件下，分别进样 1、5、10、15、20、25 μL， 分别测定重楼皂苷 VII、H、VI、II、III、I、V 对照 品峰面积。以对照品进样量对峰面积进行线性回 归，绘制标准曲线，得到回归方程。同时以信噪比 3 和 10 为标准考察检测限（LOD）和定量限（LOQ）。 2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项中的对照品溶液 在“2.1.1”色谱条件下，每次进样 10 μL，重复进 样 6 次，测得重楼皂苷 VII、H、VI、II、III、I、V 的平均峰面积分别为 141.85、179.63、107.75、321.20、 263.43、257.55、229.15，RSD 分别为 0.66%、0.53%、 0.98%、0.86%、0.85%、0.65%、0.70%（n＝6），结 果表明精密度良好。

色谱柱为 Thermore C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯 度洗脱，0～8 min，20%～40% B；8～39 min，40%～ 44% B；39～49 min，44%～47% B；49～52 min， 47%～60% B；52～60 min，60%～20% B；检测波 长 203 nm；柱温 30 ℃；体积流量 1 mL/min；进样 量 10 μL。 2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取重楼皂 苷 VII、H、VI、II、III、I、V 对照品，置 5 mL 量 瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分 别为 0.236、0.238、0.240、0.650、0.736、0.660、 0.248 mg/mL 对照品母液，在 4 ℃冰箱保存备用。 2.1.3 供试品溶液的制备 样品粉碎，过 100 目筛， 40 ℃烘箱中干燥至恒定质量，精密称取药材粉末 0.5 g（万分之一电子天平）于 10 mL 三角瓶中，加 入 75%乙醇 4 mL，于 60 ℃，53 kHz 超声处理 60 min，滤过，滤液置于 10 mL 量瓶中；向药材滤渣 中加 75%乙醇 4 mL，放置过夜，相同参数超声处。

不同产地多茎重楼根茎主要活性成分含量比 较分析 不同产地多茎重楼根茎中 VII、H、VI、II、III、 I、V 及《中国药典》2015 年版规定 4 种重楼皂苷 （I、II、VI、VII）的总含量，。对不同产地 的多茎重楼根茎中重楼皂苷 VII、H、VI、II、III、 I、V 及《中国药典》2015 年版规定的 4 种重楼皂 苷（I、II、VI、VII）总量进行显著性检验，结果 显示，不同产地多茎重楼根茎中均检测到《中国药 典》2015 年版规定的 4 种重楼皂苷（I、II、VI、 VII），不同产地多茎重楼根茎中重楼皂苷（I＋II＋ VI＋VII）总量的范围在 1.239%～6.236%，均大于 《中国药典》2015 年版一部规定的 0.60%的质量控 制标准，含量最高的为 S6（剑川马凳），最低的为S3（大理银桥），相差 5 倍多；且 S6（剑川马凳）、 S8（南涧乐秋）产地的（I＋II＋VI＋VII）总含量显 著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于其他产地； S6（剑川马凳）产地多茎重楼根茎中重楼皂苷 VII、 H、VI、II、III、I、V 及 4 种重楼皂苷（I、II、VI、 VII）的总含量显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01） 高于其他产地；S6（剑川马凳）、S8（南涧乐秋）重 楼皂苷 III 的含量分别为5.354%、4.710%，显著（P＜ 0.05）或极显著（P＜0.01）高于其他产地，且超过 S3（大理银桥）含量的 42 倍多；除 S8（南涧乐秋）、 S9（巍山龙街）、S10（巍山魏宝山）外，其他产地 均未检测到重楼皂苷 V；除 S2（云龙长新）、S3（大 理银桥）、S9（巍山龙街）外其他产地均检测到重 楼皂苷 H；不同产地多茎滇重楼主要成分含量存在 一定的差异，但总体品质较好。  一测多评法（QAMS）与外标法（EMS）测定 不同产地多茎重楼根茎主要活性成分含量比较分析 取 10 批多茎重楼根茎样品，按照“2.1.3”项 下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件 进样测定，记录各色谱峰峰面积，采用外标法对重 楼皂苷 VII、H、VI、II、III、I、V 进行定量测定， 再用所建立的 QAMS 法进行定量计算，以验证 QAMS 法用于多茎重楼中多指标评价的准确性。测得结果显示 2 种方法测得的各成分含量 无明显差异，QAMS 法可以作为一种简便准确的 质量评价模式，用于多茎重楼中 7 中甾体皂苷类主 要活性成分的含量测定。