使用超声波清洗对多指标综合评价刺五加叶适宜

刺五加叶是五加科植物刺五加 Acanthopanax seuticosus (Rupr. et Maxim.) Harms 的干燥叶片， 临床研究表明刺五加叶中含有大量对人体有益的 生物活性成分，具有调节机体免疫力、预防心脑血 管疾病及改善睡眠等功效。随着近年来对刺五加 叶的开发利用不断增加，刺五加叶颗粒、袋泡茶及 刺五加叶脑欣通等一系列产品相继推出。但现阶 段对刺五加叶的研究多集中于化学成分、药理作 用以及现代应用等方面，对刺五加叶采收 期的研究鲜有报道，而适宜的采收期是保证刺五加 叶质量的重要环节。因此，采收期的研究对刺五加 叶的开发利用具有重要意义。

目前，对刺五加叶适宜采收期研究的考察指标 较单一，难以客观、全面地反映不同时期刺五加叶 的内在品质，如陆珞等以紫丁香苷、黄酮类和 多糖为考察指标对刺五加叶的采收期进行了研究。 近年来研究发现刺五加叶苯丙素类成分含量较高， 并且具有抗炎、抗氧化等作用；原儿茶酸是多种 中药的活性成分，如益智仁、丹参、芙蓉等，而刺 五加叶中原儿茶酸的研究较少，关于原儿茶酸的药 理作用已有大量报道，其具有良好的抗氧化和神经 保护的作用。因此，本实验选取苯丙素类的 L苯丙氨酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸，黄酮类的 芦丁、金丝桃苷、槲皮素及原儿茶酸作为考察指标。 此外，产量也是判断刺五加叶适宜采收期的重要指 标，本实验测定了刺五加的百叶干质量，并与多指 标成分含量测定相结合进行了综合评价，确定刺五 加叶的最佳采收期，为刺五加叶的科学采收和合理 利用提供依据。

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国 Waters 有限公司 2998 PDA 检测器）；超声波清洗器（昆山超声）；电子天平（德国赛多利斯）；H1650台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪 器开发有限公司）；BGZ-30电热鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。 对照品 L-苯丙氨酸（批号 J04J7R8481）、原 儿茶酸（批号 Z30M6L1）、紫丁香苷（批号 P14J7F8937）、绿原酸（批号 Y24J7K16726）、咖 啡酸（批号 Y17D6C7672 ）、 芦 丁 （ 批 号 Y06J8S37439）、金丝桃苷（批号 Y04A9X62302）、 槲皮素（批号 C20J6Y1722），质量分数均≥98%，均购自上海源叶生物科技有限公司；HPLC 流动 相乙腈为色谱纯（J&K Scientific Ltd.公司）；水为 娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其余 试剂均为分析纯。 刺五加叶样品采自黑龙江省哈尔市黑龙江中 医药大学药用植物园，分别于 2018 年 6 月 3 日 （S1）、2018 年 7 月 3 日（S2）、2018 年 8 月 3 日 （S3）、2018 年 9 月 3 日（S4）、2018 年 10 月 3 日（S5）进行取样，为保证样本的代表性，对 10 棵同一年限的固定刺五加植株进行随机等量取 样、均匀混合。所有样品均由黑龙江中医药大学 中药资源学王振月教授鉴定为五加科植物刺五加 Acanthopanax seuticosus (Rupr. et Maxim.) Harms 的叶。6 月份生长旺盛阶段，叶片数不断增加， 7 月份进入生殖生长阶段，叶片数不断增加。8 月末 9 月初叶片数量不断减少，10 月份叶片泛 黄脱落。

将不同时期的刺五加叶样品分别烘干至恒定 质量，每个时期分别随机选取刺五加叶 100 片，重 复 3 次，用电子天平测定质量。

采用 Welchrom C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；流动 相梯度洗脱，洗脱程序：0～40 min，10%～36.7%A， 进样体积 20 μL；体积流量 1 mL/min；检测波长 206 nm；柱温 30 ℃；在上述条件下，8 种成分与其他 相邻峰的分离度均大于 1.5，理论塔板数以各成分 色谱峰计均高于 3 000。色谱图见图 1。

精密称取 L-苯丙氨酸、原 儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝 桃苷、槲皮素对照品适量，加甲醇溶解，配成质量 浓度分别为 0.213、0.623、1.025、1.015、0.214、 5.239、5.205、0.211 mg/mL 的对照品溶液，备用。 2.3.2 供试品溶液制备 精密称取干燥至恒定质 量的样品粉末（过 60 目筛）1.0 g，置于 10 mL 量 瓶中，加入 10 mL 甲醇，称定质量，室温下，超声 功率 480W，超声提取 60 min（每 30 分钟停止 15 min）后取出，放冷用甲醇补足减失质量，摇匀， 置于 10 mL 离心管中 4 000 r/min 离心 10 min，吸取 上层清液过 0.22 μm 微孔滤膜，即得。

经测定，不同时期刺五加百叶干质量动态变化 情况如图 2 所示。

由图 2 可知，刺五加百叶干质量在 S1～S5 生 长季节里呈不断增长趋势，在 S1～S2 期迅速增长， S2～S3 期增长减缓，S3 期之后缓慢增长，S5 期刺 五加百叶干质量达到最大值。

按照“2.6”项下的方法测定不同时期刺五加叶中8种成分的含量，变化趋势见图 3、4。 于同一地点不同时期采收刺五加叶，8 种成分 含量积累变化有差异，其中 L-苯丙氨酸和槲皮素含 量波动变化较小，原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、 咖啡酸、芦丁、金丝桃苷含量变化波动较大。结合 图 2、3 进行详细分析，在 S1 时，除原儿茶酸达到 监测全程的含量积累最大值 0.502 7 mg/g 外，其他 5 种成分含量均处于较低水平，但在 S1～S2 期间， 这 5 种成分都处于积累升高状态。在 S2 时，除原 儿茶酸含量积累有所下降外，紫丁香苷、绿原酸、 咖啡酸、芦丁、金丝桃苷这 5 种成分含量均达到监 测全程的最大值，分别 0.649 0、6.376 4、1.137 9、 42.635 7、46.733 4 mg/g。在 S3 至 S5 期间，8 种有效成分含量均呈下降趋势，以咖啡酸、芦丁、金丝 桃苷下降较为明显。在 S5 时，除 L-苯丙氨酸和紫丁 香苷外，其他 6 种有效成分含量均达到监测全程的 最小值，分别为 0.115 0、0.657 7、0.330 2、0.399 0、 0.066 4、0.048 9 mg/g。

累总量变化趋势 从图 5 可知，不同时期刺五加叶 8 种成分积累 总量（有效成分积累总量＝有效成分总量×百叶质 量）整体呈先上升后下降的变化规律。即在 S1～S2 期间总量总体呈上升趋势，到 S2 时达到最大，为 1.615 g，S2～S3 期间总量急剧下降，S3～S5 之后 随着采收时间的推迟，有效成分积累总量（每百叶） 呈明显下降趋势。

主成分分析，是考察多个变量间相关性的一种 多元统计方法，通过原始变量中导出少数几个主成 分，使它们尽可能多的保留原始变量的信息，且彼此间互不相关，将多个具有相关性指标转换成少数 几个互相独立的综合指标（即主成分），通过将各 指标得分与其权重结合进行综合评分。

4 讨论

预试验对提取溶剂（体积分数为 50%、75%、 100%甲醇）、提取时间（30、40、60 min）进行了 考察，结果表明，100%甲醇为最适宜提取刺五加叶 的溶剂，60 min 为最佳提取时间，但为了防止超声 时间过长产热，对提取效果有影响，每提取 30 min 时，会停止 15 min。因此选择 100%甲醇提取 60 min （每 30 分钟停止 15 min）。 此实验首次采用HPLC对刺五加叶中L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、 金丝桃苷和槲皮素的含量进行了测定，建立方法初 期，首先采用甲醇-水与乙腈-水，分别作为流动相， 结果表明分离效果均不好，并且难以达到基线分 离，后以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，分离效果 明显得到改善，但个别峰依旧出现严重拖尾现象，故 增加磷酸水溶液为 0.3%，结果分离效果较为理想。