羟自由基的清除作用分析-KQ3200E使用过

薏米，又叫薏苡仁，为禾本科植物薏苡（Coix lacry－ ma-jobi L.）的种仁。薏苡是一种营养丰富的粮药兼用 的一年生或多年生植物，其种仁薏米具有较全面的营 养成分和特殊的药用保健功效。薏米多糖的单糖组分 较复杂，包括葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖，是药理活性较高的物质，具有降血脂、降血糖、调 节免疫和防治肿瘤等功效。同时，薏米多糖具有良好 的耐热性能，在 100 ℃左右具有较好的稳定性；并具 有一定的抗氧化性，对超氧阴离子自由基（O2 - ·）、羟基 自由基（·OH）以及 DPPH 自由基具有清除能力。对薏 米多糖提取工艺的已有研究有水提法、超声或微波辅 助提取法、以及亚临界水萃取法等。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

薏米：市售。 1.1.2 试剂 石油醚、95 %乙醇、无水乙醇、无水乙醚、5 %苯 酚、浓硫酸、硫酸亚铁、30 %双氧水、水杨酸（分析纯）： 天津市福晨化学试剂厂。

1.1.3 仪器

AUV120 电子分析天平：上海玉博生物科技有限公 司；WG-71 鼓风干燥机粉碎机：天津市泰斯特仪器有限 公司；HH-W600 数显三用恒温水箱：金坛市亿通电子 有限公司；KQ3200E 超声波清洗器：昆山舒美超声仪 器有限公司；R-201 真空旋转蒸发器：郑州长城科工贸 有限公司；UV2800 紫外可见分光光度计：上海舜宇恒 平科学仪器有限公司；TG16G 高速离心机：湖南省凯达 科学仪器有限公司；GDYQ-701S 样品提取仪：长春小 天鹅仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 薏米多糖提取工艺流程

筛选薏米→粉碎→脱脂→超声水浴浸提→过 滤→旋转蒸发→滤液醇沉→离心→洗涤→干燥→粗 多糖→溶解→待测液→测吸光度 关键步骤如下：
1）薏米脱脂：准确称取 20 g 薏米粉，置于索氏提 取器，加石油醚回流（60 ℃）脱脂 2 次，每次 2 h 得到脱 脂产物，于 3 ℃贮藏备用。
2）超声水浴浸提：取一定量的脱脂薏米粉，加入蒸 馏水，搅拌均匀，超声提取 50 min 后，在电热恒温水浴 锅中加热提取多糖。
3）滤液醇沉：将上清液浓缩至原来的三分之一，再 加入 3 倍体积的 95 %乙醇溶液，静置 30 min 后离心 （转速为 6 500 r/min，时间为 20 min），去上清液，得沉 淀物，此沉淀物就是粗多糖。
4）洗涤：依次用无水乙醇、乙醚洗涤 2 次，以便破 坏水解残留的脂溶性杂质。

1.2.2 测定多糖含量

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
1）标准曲线绘制：精密称取干燥葡萄糖 0.151 g， 加蒸馏水溶解，定容至 100 mL 容量瓶中，充分摇匀，得 到质量浓度为 100 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的葡萄糖标准溶液分别置于100 mL 容量瓶中，定容、摇匀。分别吸取各溶液 2 mL 于试管中，分别加入 5 %苯酚 1.0 mL、浓硫酸 5.0 mL， 用 2.0 mL 蒸馏水做空白对照和调零，静置 10 min，于 60 ℃恒温水浴 10 min 取出，迅速冷却至室温 20 ℃。在 波长为 490 nm 下测定吸光度，绘制标准曲线并进行回归 处理，得到回归方程为 Y=0.011 9x+0.010 3，R2 =0.993 2。 在 0~80 μg/mL 范围内，吸光度和葡萄糖标准液的浓度 呈良好的线性关系。
2）待测液中多糖的测定：精确吸取待测液 2 mL 于 10 mL 的容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀、静置。 从中吸取 2.0 mL 液体至试管中，加入 5 %苯酚 1.0 mL、 浓硫酸 5.0 mL，摇匀。室温 20 ℃静置 10 min 后放置 60 ℃ 恒温水浴 10min 取出，迅速冷却至室温 20 ℃。在波长为 490nm 下测得吸光度值，根据标准曲线回归方程计算 出多糖浓度，求出多糖得率。多糖得率的计算公式如下： 得率/%= C×V M ×100 式中：C 为薏米多糖浓度，mg/mL；V 为稀释总体 积，mL；M 为薏米粉的质量，g。

1.2.3 单因素试验

1）料液比的选择：固定水提取液 pH 值为 5.0，水 浴加热温度为 70 ℃，提取 3 h，料液比分别设置为 1 ∶ 10、 1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30（g/mL），平行试验 3 次，研究 料液比对薏米多糖得率的影响。
2）提取温度的选择：固定水提取液 pH 值为 5.0， 体积 60 mL，水浴加热温度分别设置为 65、70、75、80、 85 ℃，提取 3 h，平行试验 3 次，研究提取温度对薏米 多糖得率的影响。
3）pH 值的选择：固定水提取液体积 60 mL，水浴 加热温度为 70 ℃，pH 值分别设置为 3.5、4、4.5、5、5.5， 提取 3 h，平行试验 3 次，研究 pH 值对薏米多糖得率 的影响。
4）提取时间的选择：固定水提取液 pH 值为 5.0， 体积 60 mL，水浴加热温度为 70 ℃，提取时间分别设 置为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，平行试验 3 次，研究提取 时间对薏米多糖得率的影响。

1.2.4 正交优化试验

在单因素试验的基础上，以提取温度、提取时间、 料液比及 pH 值为试验因素，根据单因素试验结果，进 行四因素三水平试验确定水提醇沉法提取薏米多糖 的最佳工艺参数。

1.2.5 羟基自由基清除试验

薏米多糖及维生素 C 对羟基自由基的清除率，采 用水杨酸法进行测定。对羟基自由基的清除率按下式 计算：E/%= A0-（Am-An ） A0 ×100
式中：E 为羟基自由基的清除率；A0 为空白对照 液的吸光值；Am 为加入多糖后的吸光值；An 为不加 H2O2 时多糖的吸光值。

2 结果与分析

随着液体量的增加，薏米多糖得率逐 渐提高，当料液比为 1 ∶ 25（g/mL）时，薏米多糖得率达 到最高，之后下降。这可能是由于一定比例的料液比 已经使溶出的多糖量达到平衡，继续增大料液比，可 能使其他物质溶出，多糖的相对得率就降低了。另外， 料液比过大会增加溶剂的用量，本着节约成本的原 则，料液比为 1 ∶ 25（g/mL）左右为宜。随着提取温度升高，薏米多糖得率不 断增加，在 75 ℃时，薏米多糖得率最高，之后缓慢下 降。这可能是由于温度升高，分子运动速度加快，多糖 更容易浸出，但是过高的温度易导致多糖结构被破 坏，进而造成多糖含量降低。因此，提取温度应控制在75 ℃左右为宜。薏米的多糖得率随着 pH 值的升高 而增大，pH 值为 4 时多糖得率达到最大，继续升高 pH 值多糖得率开始降低，但在 pH 值为 4.5 和 5 时降低幅 度不明显。这可能是由于 pH 值为 4~5 时，有利于多糖 最大程度的溶出，继续升高 pH 值会影响多糖的结构 稳定性。因此，pH 值应控制在 4~5 之间。随着提取时间增加，薏米多糖得率 不断增加，在提取时间为 1.5 h 时，薏米多糖得率最高， 之后逐渐下降。这可能是由于提取时间过短，多糖还 没有充分溶出，时间过长又使其他物质的溶出，影响 多糖的浸出影响，或多糖提取物中的结构分被破坏。 因此，提取时间选择 1.5 h 左右为宜。

3 讨论与结论

多糖广泛存在于植物体内，具有较高的药理活 性。水提醇沉法目前在植物活性多糖提取中应用最 多，利用该法提取黄精多糖肽得率为 0.34 %，提取山 苦茶、苦瓜、芦竹及向日葵茎芯等多糖得率分别 为 1.012 %、3. 12 %、4. 80 %和 6. 56 %。可见，不同的植 物利用水提醇沉法提取多糖得率差别较大。利用超声 波辅助提取，多糖的浸提过程和活性不发生改变，浸 提时间缩短，可以提高提取效率。本试验在超声辅助 水提醇沉法的最优条件下，即提取时间为 2 h，提取温 度为 75 ℃，pH 值为 5，料液比为 1 ∶ 20（g/mL）时，薏米 多糖得率为 1.56 %，高于刑真等利用热水浸提法提 取薏米多糖的提取率 1.25 %以及利用超声波辅助提 取薏米多糖的提取率 1.41 %。综合考虑时间和能耗因 素，超声波辅助水提醇沉法适宜于在省时节能的情况 下提取薏米多糖。 羟基自由基能破坏细胞膜、杀死机体红细胞、诱 导基因突变、诱发多种疾病，进而引起生命发生系统 性的紊乱。研制价格低廉经济有效的抗氧化剂是对抗 羟基自由基的有效途径。研究表明，羊肚菌、别克参、 玫瑰茄等的多糖均具有一定的抗氧化能力。本试验 中，在相同质量浓度下，薏米多糖提取物对羟基自由 基具有一定的清除作用，但效果弱于维生素 C。因此， 加强薏米活性成分研究，扩大薏米资源的开发利用， 有助于进一步推动薏米产业化发展。