超声清洗器在秦皮指纹图谱研究的应用

秦 皮 是 木 犀 科 植 物 苦 枥 白 蜡 树,白蜡树、尖 叶 白 蜡 树 ． 和宿柱白蜡树．的干燥枝 皮或干皮，为临床常用中药，具有清热燥湿、收涩止 痢、止带、明目之功效，临床上多用于湿热泻痢、赤白 带下、目赤肿痛、目生翳膜等症。现代药理学研究 表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。 除《中国药典》２０１５年版规定的这４种秦皮外，同属 植物秦岭白蜡树、黑蜡子树、毛白蜡树也混淆于市场 中做秦皮用，且由于受地理因素和生长环境的 影响，不同产区包括栽培和野生秦皮的化学组成不 尽相同。对药 材 的 外 观 检 查、鉴 别 及 对 几 个 成 分的含 量 测 定已 不 能 完 全 反 映 其 内 在 质 量。 中药指纹图谱因能反映组成中药多种化学成分的整 体全貌，已成为国际公认的控制中药或天然药物质 量的有效手 段。为更全面表征秦皮的整体特 征，本研究拟建立秦皮药材及其混淆品的高效液相色谱指纹图谱分析方法，并对不同品种秦皮间的 差异进行比较，以期为秦皮的质量控制提供新依据， 报告如下。

Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪，包括二 极管阵列检测器、四元泵、自动进样器、在线脱气系 统和柱温箱；ＡｇｉｌｅｎｔＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ 色谱工作 站（Ａｇｉｌｅｎｔ科技有限公司）。分析天平，ＢＰ２１１Ｄ 型 （北京赛多利斯仪器有限公司）；超声波清洗器， ＫＱ５２００Ｅ型 （江苏昆山市超声仪器有限公司 ）； ＬＧ１６－Ｂ型雷勃 尔 高 速 离 心 机（北京雷勃尔离心机 有限 公 司）。中 药 色 谱 指 纹 图 谱 相 似 度 评 价 系 统 （２００４Ａ）。

色谱纯甲醇（美国Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ公司）用 于秦皮样品提取物的制备和分析；色谱纯乙酸购于 迪马科技公司；水为娃哈哈纯净水（中国杭州娃哈哈 集团有限公司）。 对照品 秦 皮 甲 素 （批 号 为 １１０７４１－２００５０６）、秦 皮乙 素 （批 号 为 １１０７４１－２００５０６）、秦 皮 素 （批 号 为 １１１７３１－２００５０１）、莨 菪 亭（批 号 为 １１０７６８－２００５０４）、异莨菪亭（批号为１１１７４１－２００５０１）、丁香苷（批号为 １１１５７４－２００６０３），均由中国食品药品检定研究院提 供（中国北京）。对照品秦皮苷（批号为２０１１１２１４）、 橄榄 苦 苷 （批 号 为 ２０１１１２１４）、毛 柳 苷 （批 号 为 ２０１１０９２１）购 于 鼎 瑞 化 工（上 海）有 限 公 司；对 照 品 ６－羟基－７，８－二甲氧 基 香 豆 素、８－羟 基－６，７－二 甲 氧 基 香豆素由中国中医科学院中医基础理论研究所提 供，经 ＨＰＬＣ分析，纯度均大于９８％。 ５５批样品采集于国内各产地，为不同批次样品 （表１）。样 品 Ａ１～Ａ５、Ｂ１～Ｂ５、Ｃ１～Ｃ５、Ｄ１～Ｄ５ 分别来源于白蜡树、尖叶白蜡树、苦枥白蜡树和宿柱 白蜡树；Ｗ１～ Ｗ３ 秦皮混淆品分别来源于毛白蜡 树、黑蜡子树和秦岭白蜡树。以上样品均由中国中 医研究院刘丽梅教授提供。样品 Ｓｄ为秦皮对照药 材———白蜡树，购于中国食品药品 检 定 研 究 院。市 售样品Ｓ１～Ｓ３１采购于全国各药店。

１．３ 色 谱 条 件

色 谱 条 件：ＺｏｒｂａｘＳＢ－Ｃ１８色 谱 柱 （２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；柱温３０ ℃。流动相：Ａ 为甲醇，Ｂ为０．５‰乙酸水缓冲溶液。梯度洗脱，洗 脱程序：５％ ～２０％ Ａ（０～５ ｍｉｎ），２０％ Ａ（５～２０ ｍｉｎ），２０％～６０％ Ａ（２０～７５ｍｉｎ），进样前预平衡８ ｍｉｎ。流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。进 样 量：１０μＬ。检 测 波 长：２３０ｎｍ。

分别精密称取１１种化学 成分对照品适量，溶解于甲醇配制成一定浓度的贮 备液。分别精密量取一定体积贮备液混匀于１０ｍＬ 量瓶中，加７３％甲 醇 定 容，得 混 合 对 照 品 溶 液。最 终混合对照品溶液中各对照品浓度分别为秦皮甲素 ４５１．９１ｍｇ／Ｌ，秦皮乙素８５．００ｍｇ／Ｌ，秦皮苷３８８． ０２ｍｇ／Ｌ，秦皮素９４．０１ｍｇ／Ｌ，莨菪亭５．１３ｍｇ／Ｌ， 异莨菪亭４．２５ｍｇ／Ｌ，橄榄苦苷５．０８ｍｇ／Ｌ，毛柳苷 ５．４８ｍｇ／Ｌ，丁 香 苷１０．１５ ｍｇ／Ｌ，６－羟 基－７，８－二 甲 氧基香豆素５．４０ｍｇ／Ｌ，８－羟基－６，７－二甲氧基香豆 素４．０５ｍｇ／Ｌ。所 有 对 照 品 溶 液 储 存 于４ ℃环 境 中，以备使用。

将５５批次干燥药材分别 粉碎，过６０目筛备用。取秦皮干燥粉末约０．１ｇ，精密称定，置 具 塞 锥 形 瓶 中，精 密 加 入 ７３％ 甲 醇 １０ ｍＬ，称定重量，于 冰 水 浴 中 超 声 提 取６５ｍｉｎ后，取 出，放 冷，用 ７３％ 甲 醇 补 足 减 失 重 量，摇 匀，于 １４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液过０．４５μｍ 微 孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶 液和供试品溶液各１０μＬ，注入高效液相色谱仪，在 确定的色谱条件下检测，记录色谱图，按秦皮甲素峰 计算理论板数约为１６０００，各色谱峰分离度均符合 要求。

精 密 吸 取 秦 皮 药 材（Ｓ１１）同 一供试 品 溶 液 １０μＬ，连 续 进 样 ６ 次，记 录 指 纹 图 谱。以秦皮甲素峰的保留时间和峰面积为１．０，计 算各峰相对保留时间、相对峰面积及相对标准偏差 （ｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）。各主要色谱峰 相对保留时 间 ＲＳＤ 为０．０２％～０．３８％，相 对 峰 面 积 ＲＳＤ为１．５３％～３．５５％，说明精密度良好。

精密称取同一批号的供试品 ６份，按照上述 方 法 制 备 供 试 品 溶 液，分 别 进 样，记 录指纹图谱。以秦皮甲素色谱峰的保留时间和峰面 积为１．０，计算各峰相对保留时间、相对峰面积及其 ＲＳＤ。各 主 要 色 谱 峰 相 对 保 留 时 间 ＲＳＤ 为 ０．０３％～０．６７％，相 对 峰 面 积 ＲＳＤ 为 １．１５％ ～ ３．９８％，表明方法重现性良好。

精密吸取同一供试品溶液１０ μＬ，分别在０，１．５，３，６，９，１２，１８，２４，３６，４８，７２ｈ各 进样１次，记录指纹图谱。以秦皮甲素色谱峰的保 留时间和峰面积为１．０，计算各峰相对保留时间、相 对峰 面 积 及 其 ＲＳＤ。各 主 要 色 谱 相 对 保 留 时 间 ＲＳＤ 为 ０．０３％ ～０．８６％，相 对 峰 面 积 ＲＳＤ 为 １．７５％～４．９８％，说明样品７２ｈ内稳定。

秦皮样品指纹图谱中主要色谱峰 分别取１１种化学成分混合对照品溶液进样分析， 根据相同色谱分离条件下，同一化合物保留时间相 同、紫外光谱一致的原则，比较供试品和各对照品的 色谱峰，指认化合物。通过比较秦皮供试品和各对 照品的色谱峰保留时间和紫外光谱图，指认出１１个 化合物的色谱峰，分别是毛柳苷、秦皮甲素、丁香苷、 秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素、异莨菪亭、莨 菪 亭、６－羟 基－７，８－二甲氧基香豆素、８－羟基－６，７－二甲氧基香豆 素和橄榄苦苷。

为确保指纹图谱信息的丰富程度和较好分离情 况、较大指纹信号和良好均化程度，同时又具有较好 的精密度和重现性，指纹图谱检测条件的选择至关 重要。本研究采用 Ｃ１８色 谱 柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ， ５μｍ），对流动 相 的 组 成、配 比、检测波长等因素进 行优化，确定最佳色谱条件。在流动相系统的选择 中，分别以甲 醇－水，甲 醇－１ ｍｍｏｌ／Ｌ 乙 酸 铵，甲 醇－０．５‰乙酸水缓冲溶液，甲醇－１‰乙酸水缓冲 溶液等不同浓度、不同比例的流动相系统进行等度 和梯度洗脱试验，结果表明，用甲醇－０．５‰乙酸水 缓冲溶液进行梯度洗脱为佳，加入乙酸后峰形尖锐 且分离度较好，在调整好流动相的不同时间洗脱比 例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易 漂移，有利于指纹图谱的分析。