质谱法测定枸杞多糖中单糖组成-KQ-500DE的使用

植物多糖（ｐｌａｎｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）是从植物中 提取得到的一种富含醛单糖（鼠李糖、阿拉伯糖、木 糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等）和酮单糖（果糖）、 通过糖苷键连接在一起形成的多聚物。大量研究证 明，许多植物多糖均具有多种生物活性和生理功能， 如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、 控制血糖以及保护肝功能等，而且对机体无毒 副作用。近几十年，已有近 10 种植物多糖（如枸杞 多糖、香菇多糖、人参多糖以及猪苓多糖等）用于抗 肿瘤、抗艾滋病及糖尿病治疗，并已进入临床实验阶段。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

高效液相色谱－串联质谱（ＬＣ ／ ＭＳ－2010ＥＶ，日 本 Ｓｈｉｍａｄｚｕ 公 司）；色 谱 柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ－Ｃ18 （100 ｍｍ×4. 6 ｍｍ，3. 5 μｍ）；ＫＱ－500ＤＥ 型超声波清洗 仪（昆山舒美超声仪器有限公司）；ＬＧＪ－10Ｃ 真空冷冻 干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；ＪＣ－ＺＦ 型 旋转蒸发仪（上海丹鼎国际贸易有限公司）。 单糖标准品：果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ，Ｆｒｕｃ）、葡萄糖 （ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｇｌｕ）、鼠 李 糖 （ｒｈａｍｎｏｓｅ，Ｒｈａ）、木 糖（ｘｙｌｏｓｅ，Ｘｙｌ）、阿拉伯糖（ａｒａｂｉｎｏｓｅ，Ａｒａ）、甘露糖 （ｍａｎｎｏｓｅ，Ｍａｎ）、半乳糖（ｇａｌａｃｔｏｓｅ，Ｇａｌ）、脱氧 核糖（ｒｉｂｏｓｅ，Ｒｉｂ）（纯度＞99％，上海中秦化学试剂 有限公司）；双糖标准品：蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）、麦芽糖 （ｍａｌｔｏｓｅ）（纯度＞ 99％，上海中秦化学试剂有限公 司）；衍生化试剂：ＰＭＰ（上海晶纯试剂有限公司）； 透析袋（截留相对分子质量 8 000，上海新睿生物科 技有限公司）；ＳＺ－97 自动三重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；氨 水、盐 酸、氢氧化钠及三氟乙酸 （ＴＦＡ）等其余试剂为分析纯（天津市大茂化学试 剂厂）。

1．2 标准溶液的制备

准确称取 0. 018 0 ｇ 单糖标准品，用氨水定容至 5 ｍＬ，各单糖标准溶液的质量浓度 均 为 3 600 ｍｇ ／ Ｌ，储存在 4 ℃冰箱中备用。 分别准确称取 8 种单糖标准品各 0. 036 ｇ，用浓 氨水（28％）定容至 10 ｍＬ，混合单糖标准溶液中各 单糖的质量浓度均为 3 600 ｍｇ ／ Ｌ，储存在 4 ℃冰箱 中备用。 准确移取不同体积的上述混合单糖标准溶液 （3 600 ｍｇ ／ Ｌ），用氨水稀释成系列质量浓度（0. 18 ～ 38. 8 ｍｇ ／ Ｌ）的标准工作溶液。 从市场购买 4 个地区种植的枸杞干果。1＃样品 为宁夏中宁枸杞，2＃样品为新疆精河枸杞，3＃样品为 河北苦枸杞，4＃样品为云南黑枸杞。

1．3 样品处理

枸杞中多糖的提取采用 80％ （ｖ ／ ｖ）的乙醇提取 法。将枸杞干果置于真空干燥烘箱内，于 50 ℃下烘干后粉碎，称取干燥枸杞干果粉末置于烧杯 中，加体积分数为 80％ 的乙醇，在 80 ℃水浴中提取 0. 5 ｈ，过滤滤渣，加蒸馏水在 100 ℃水浴中再提取 4 ｈ，重复 2 次，合并滤液。 滤液采用 Ｓｅｖａｇ 法脱去蛋白质后，加入活性 炭，70 ℃水浴 1 ｈ，过滤除去活性炭。滤液用旋转蒸 发仪浓缩至黏稠，得到去除蛋白质和色素的粗多糖。 取适量枸杞粗多糖置于透析袋中（截留相对分子质 量 8 000），吊于装有蒸馏水的大烧杯内，使其充分 与水接触，多次换水，透析 24 ｈ 以除去小分子化合 物和游离的单糖。将透析过的多糖置于蒸发皿中， 冷冻干燥，得到相对纯净的枸杞多糖。将 4 个不同 产地 10 个批次的枸杞干果按上述方法提取，制得枸 杞多糖。

2 结果与讨论

在强碱 ＮａＯＨ 条件下，采用 ＰＭＰ 衍生化单糖 是当前最为普遍的单糖修饰技术，但是很难检测到 ＰＭＰ 衍生化果糖产物的信号。因此，考 察 ＰＭＰ 衍生化单糖环境对衍生化产物的影响尤为 必要。分别移取 Ｆｒｕｃ 和 Ｇｌｕ 水溶液 300 μＬ 于离心管 中，加入 300 μＬ 0. 3 ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＭＰ－甲醇溶液和 300 μＬ 0. 3 ｍｏｌ ／ Ｌ 的氢氧化钠溶液，涡旋混合，按 1. 3. 4 节方法进行衍生化实验。在 ＮａＯＨ 环境下，ＰＭＰ 衍 生化 Ｇｌｕ 和 Ｆｒｕｃ 产物的总离子流色谱图及其对应 的质谱图，可观察到 ＰＭＰ 衍生化 Ｇｌｕ 产物的 离子化信号很弱，其衍生化产物的加和离子 ｍ ／ ｚ 为 511，和一致。ＰＭＰ 修饰果糖的衍生化产 物无信号，也一致。实验结果再次证 明，在 ＮａＯＨ 的强碱性环境下，ＰＭＰ 难以修饰果糖。 以氨水代替 ＮａＯＨ，进一步考察在温和的ＮＨ3·Ｈ2Ｏ 环境下，ＰＭＰ 能否衍生化果糖。

3 结论

在温和的 ＮＨ3·Ｈ2Ｏ 环境下，采用 ＰＭＰ 衍生 化标记单糖，基于 ＨＰＬＣ－ＭＳ 联用技术，在正离子 ＳＩＭ 模式下，成功确认和测定了果糖和多种醛单糖 （Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｇａｌ、Ｇｌｕ、Ｘｙｌ、Ａｒａ、Ｒｉｂ）。首次提出在 温和的 ＮＨ3·Ｈ2Ｏ 条件下，ＰＭＰ 标记果糖的衍生化 机理。以双糖为目标物，优化水热法酸催化水解多 糖的最佳水解温度（70 ℃）和水解时间（50 ｍｉｎ）， 建立了水热法水解多糖和温和氨水环境下 ＰＭＰ 柱 前标记多糖水解产物中的果糖和多种醛单糖的确认 方法及含量测定方法，成功用于枸杞多糖水解产物 中单糖组分的确认及含量测定。