杜仲平压片是由杜仲叶经水煎煮、提取加工制 成的片剂,能降血压,强筋健骨;适用于高血压、 腰膝酸痛、筋骨痿软等症。现代研究表明,杜仲叶 中的有效活性成分主要包括以绿原酸为代表的苯丙 素类、芦丁为代表的黄酮类等化学成分。绿原酸 是杜仲叶的主要活性成分,具有利胆、抗菌、抗病 毒、降压等多种药理作用。芦丁具有降血压、降血 脂、抗氧化以及舒张血管等广泛的生物学活性 。 杜仲平压片的生产厂家较多,为保证该药物治疗效 果的稳定,需对该制剂质量进行严格控制。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1260 高效液相色谱仪(配制 DAD 型检测器),美国 Agilent 公司;AUW-220D 电子天 平,日本岛津公司;KQ-300DE超声清洗器,昆山舒美超声仪器有限公司。
1.2 药物及试剂
绿原酸(批号:110753-201716,纯 度:99.3%)、芦丁对照品(批号:100080-201408, 纯度:92.8%),中国食品药品检定研究院;新绿原 酸(批号:18032403,纯度:99.07%),成都曼思特 生物科技有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯,德国 MERCK公司;其余试剂、试药均为分析纯,水为纯 水。17批杜仲平压片样品来源,见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Thermo Hypersil Gold-C18柱 (4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1% 磷酸溶液(B);梯度洗脱:0~10 min:5%→10%A, 10~20 min: 10% →16% A, 20~30 min: 16% A, 30~35 min: 16% →25% A, 35~45 min: 25% A, 45~45.1 min:25%→5%A,45.1~50 min:5%A;流 速:1.0 mL·min- 1 ;柱温:30 ℃;检测波长:354 nm;进样量:10 μL。
2.2 溶液制备
2.2.1 供试品溶液
取杜仲平压片样品适量,除去薄 膜衣或糖衣,研细,取粉末约1 g,精密称定,置锥 形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,称定质量,超声30 min,放冷,再次称定质量,用 50%甲醇补足减 失的质量,摇匀,滤过,即得。
2.2.2 混合对照品溶液
分别精密称取新绿原酸、绿 原酸和芦丁对照品适量,用 50%甲醇定容至刻度, 制成浓度分别为38.21、255.61、19.72 μg · mL-1 的对 照品储备溶液。
2.2.3 阴性样品溶液
按杜仲平压片处方工艺,制成 只含辅料的阴性样品。取阴性样品适量,研细,按 2.2.1 项下方法制成阴性样品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
分别精密吸取同一供试品溶液 (批号:171510)10 μL,按 2.1 项下色谱条件,连续 进样6次,记录色谱图。以绿原酸为参照峰(S),计 算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显 示,相对保留时间相对标准偏差(RSD)值均小于 2%,相对峰面积RSD值均小于3%,表明仪器精密度 良好。
2.3.2 稳定性试验
分别精密吸取同一供试品溶液 (批号:171510)10 μL,按 2.1 项下的色谱条件,分 别在0、2、6、10、18、24 h进样,记录色谱图。以 绿原酸为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留时间 和相对峰面积。结果显示,相对保留时间 RSD 值均 小于 1%,相对峰面积 RSD 值均小于 3%,表明供试 品在24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
取同一批杜仲平压片样品(批 号:171510),依照2.2.1项下方法平行制备6份供试 品溶液,按2.1项下的色谱条件进行分析,记录色谱图。以绿原酸为参照峰(S),计算各共有峰的相对保 留时间和相对峰面积。结果显示,相对保留时间 RSD 值均小于 2%,相对峰面积 RSD 值均小于 3%, 表明该方法重复性良好。
3 讨论
在比较了不同色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Waters Sunfire C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)、Thermo Hypersil Gold-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),不同梯度洗脱体系(乙腈水,乙腈-0.5%乙酸溶液,乙腈-0.1%磷酸溶液、甲 醇-0.1%磷酸溶液不同波长(采用DAD检测器 对供试品溶液进行紫外全波长扫描) 对指纹图谱测 定的影响的基础上,选择了本实验方案,实验结果 显示采用Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱、以乙腈0.1%磷酸为流动相梯度洗脱、在波长 354 nm 条件 下,色谱峰信息较为丰富,各特征峰对称性良好, 吸收较大、分离效果为最好,故最终确定2.1项下的 色谱条件作为杜仲平压片样品指纹图谱测定的色谱 条件。