超声清洗器对于溪黄草中酚酸类成分测定的

溪黄草为唇形科香茶菜属线纹香茶菜 Isodon striatus (Benth.) Kudo 或溪黄草 I. sorra (Maxim.) Kudo 的干燥地上部分，《广西中药材标准》《广东中 药材标准》均有收载。溪黄草具有清热、利湿、退 黄的功效，用于湿热黄疸、湿热泻痢、急性黄疸型 肝炎、急性胆囊炎而有黄疸者。溪黄草在广东各 地临床应用较为普遍，并开发出多种中成药或保健 品，如溪黄草冲剂、溪黄草茶和溪黄八珍茶等。溪 黄草中主要含有酚酸类、黄酮类、香豆素、挥发油 等成分。药理学实验表明，溪黄草的水提物具有 抗炎、保肝作用，其中抗炎、抗病毒作用的主要 成分为酚酸类化合物。因此，酚酸类成分对溪黄 草的质量控制具有一定的意义。目前，《中国药典》 还未曾收录溪黄草中多种酚酸类成分的检测标准， 且相关研究较少。本研究建立了同时测定溪黄草 中有机酸的方法，采用主成分分析将不同产地的溪 黄草进行区别归属，分析出哪些主要成分可用于质 量控制，为溪黄草的质量控制和临床用药选择提供 依据。

Agilent LC-1260 型高效液相色谱仪系列；万分 之一 BS224S 型电子天平（Sartorius）；十万分之一 AUW220D 型电子天平（日本岛津公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器由巩义市予华仪器有限责任公 司生产；KQ5200 型水浴锅由昆山市超声仪器有限 公司生产。 绿原酸（批号 110753-201415）、隐绿原酸（批 号 110753-201314）、咖啡酸（批号 110885-200102）、 迷迭香酸（批号 111871-201404）对照品均由中国 食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯（Merck）， 水为超纯水，其余试剂均为分析纯。 溪黄草药材共 20 批，分别购于广东、福建，经 江西中医药大学龚建平教授鉴定为溪黄草 Isodon sorra (Maxim.) Kudo 的干燥地上部分。

Cosmosil 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：甲醇–0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脱（0～ 28 min，12%～26%甲醇；28～38 min，26%～42% 甲醇；38～55 min，42%甲醇）；体积流量为 1.0 mL/min；柱温为 30 ℃；检测波长为 330 nm；进样 量 10 μL。色谱图的各峰与相邻峰的分离良好，见 图 1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香 酸对照品适量，加入 70%乙醇配成单一对照品储备 液，再分别取各储备液，制成含上述 4 个成分分别 为 14、26、12、240 μg/mL 的混合溶液，即得。

取溪黄草药材粉末（过 4 号筛）约 0.5 g，精密 称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%乙醇 25 mL， 称定质量，回流提取 30 min 后，再次称定质量，用 70%乙醇补足减失质量，滤过，滤液经 0.22 μm 微 孔滤膜滤过，即得。

精密吸取混合对照品溶液 1、3、6、10、15、 20 μL，按上述色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐 标，进样量为横坐标进行线性回归，得回归方程。 绿原酸：Y＝6 626.752 2 X－0.421 6（r＝0.999 8）； 隐绿原酸：Y＝2 852.045 2 X－0.4256（r＝0.999 8）； 咖啡酸：Y＝6 971.958 9 X－0.321（r＝0.999 9）；迷 迭香酸：Y＝1 772.000 6 X＋3.896 9（r＝0.999 7）。 绿原酸在 0.014～0.280 μg、隐绿原酸在 0.026～ 0.520 μg、咖啡酸在 0.012～0.240 μg、迷迭香酸在 0.24～4.80 μg 与峰面积呈良好的线性关系。

取混合对照品溶液，连续进样 6 次，测定峰面 积，结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰 面积的 RSD 值分别为 0.53%、0.45%、0.44%、1.32%。

取批次 S8 的溪黄草样品，制备供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进行测定， 结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰面积 的 RSD 值分别为 0.87%、1.26%、1.43%、0.53%。 结果表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

取批次 S8 溪黄草样品 6 份，制备供试品溶液， 进样测定，结果绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭 香酸平均质量分数分别为 0.418 2、0.061 3、0.345 1、 0.442 3 mg/g，RSD 值分别为 1.22%、2.32%、1.22%、 0.37%。

取批次 S8 的溪黄草样品约 0.5 g，精密称定 6 份，按 80%、100%、120%的量各加入绿原酸、隐 绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸对照品，制备供试品溶 液，进样测定，计算加样回收率，结果绿原酸、隐 绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸平均回收率分别为 100.63%、99.08%、99.30%、101.23%，RSD 值分别为 0.92%、1.34%、2.05%、0.86%。

取 20 批溪黄草样品各 3 份，制备供试品溶液， 采用标准曲线法计算绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和 迷迭香酸的质量分数，见表 1。

采集 20 批溪黄草中 4 个成分定量数据，运用 SIMCA 13.0 软件进行主成分分析，将不同产地的溪 黄草样本分为 2 类，即 S1～S13、S14～S20，前者 来源广东，后者来源福建，可直观地发现不同地理 来源的溪黄草的差异。将所得主成分经正交偏最小 二乘法（OPLS-DA）处理，得到更确切的结果。统 计结果对区分产地的差异性提供了依据，见图 2。 将绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸的质 量分数进行聚类分析，用聚类热图显示结果，见图 3。可见咖啡酸、迷迭香酸是两个不同产地溪黄草构 成差异的主要原因。

以甲醇作为流动相较乙腈的分析效果更佳，且 流动性中含有的少量醋酸可较好地改善峰形。结合 酚酸类化合物的结构特征，最终选定 330 nm 为检测波长较为合适。 成分测定结果表明，不同产地的 20 批溪黄草样 品中，4 个酚酸类成分含量有一定的差异，迷迭香 酸的平均含量较其他成分高，其次是咖啡酸。根据 主成分分析、聚类分析结果，所收集的广东批次与 福建批次能较好区分，说明不同省份对溪黄草中酚 酸含量的影响较为显著，尤其是咖啡酸和迷迭香酸， 可作为差异性的标记成分。因此，在针对某一成分 起效时，可以选定特定产地的药材入药，如溪黄草 水提物中的咖啡酸具有抗肝炎作用，就可选用 该成分含量较高的福建产区的药材。主要成分的差 异性，对产地的差异具有一定的影响，而药效成分 是否与主要成分为同一物质，则需要后期的药效实 验以验证。